sciencetalk

L-alanine + oxoglutaraat <--ALAT--> pyruvaat + L-glutamaat

Pyruvaat + NADH + H+ <-- LD--> NAD+ + lactaat

Wanneer de NADH wordt omgezet in NAD+ veranderd dan de ph? Zo ja hoe berekent men dit dan?

Ik heb ook nog een protocol, hier in staat misschien nuttige informatie voor degene wie mij kan helpen:

Protocol ALAT

Referentiewaarden:

- Vrouwen: <31 U/l

- Mannen: <41 U/l

Benodigdheden:

- Serum (hemolyse vrij), plasma (EDTA/Heparine)

- R1:

o TRIS-buffer (pH 7.5, 100 mmol/l)

o L-Alanine (500 mmol/l)

o LDH (lactaatdehydrogenase, ≥1200 U/l

- R2:

o 2-Oxoglutarate (15 mmol/l)

o NADH (0.18 mmol/l)

Werkreagens bereiden:

- Voor Start reagent procedure: R1 en R2 zijn klaar voor gebruik

- Voor Sample Start-procedure (monoreagent): Mix R1 met R2 in verhouding 5:1.

o 1 maand houdbaar bij 2-8°C

o 5 dagen houdbaar bij 18-25°C

Werkwijze:

- Sample start procedure (monoreagent): mix 1 ml werk reagens en 100 microliter monster en incubeer 1 minuut.

- Meet de verandering in absorptie per minuut gedurende drie minuten.

- Start reagent procedure: Mix 1 ml R1 en 100 microliter monster en wacht 1 minuut.

- Voeg 200 microliter R2 toe en mix, incubeer 1 minuut bij 37°C, meet de verandering van de absorptie per minuut bij 340 nm gedurende 3 minuten.

TRIS-buffer (pH 7.5, 100 mmol/l)

Waarom zou dit in het reactiemengsel aanwezig zijn?

Ja die buffer die vangt als het goed is de pH verandering op.. maar zou ik het ook zonder die buffer uit kunnen voeren? Want ik heb juist pH verandering nodig!

Dus als het zonder die buffer kan.. treedt er dan pH verandering op?

Je kunt de ALAT bepaling uitvoeren zonder de buffer maar dan zal het resultaat niet meer reproduceerbaar zijn omdat de enzymactiviteit pH afhankelijk is.

Zonder de buffer zul je de pH ook niet kunnen berekenen omdat je monster(serum?) eiwitten en andere bufferende stoffen bevat.

Waarvoor heb je de pH verandering nodig?

Nouja.. ik moet een soort van point of care gaan ontwikkelen om onderandere een verhoogd of verlaagde ALAT waarde aan te tonen.. en mijn eerste gedachte ging uit naar pH verandering.. maar dat gaat dus niet werken. Heeft u toevallig nog een suggestie hoe ik dit eventueel makkelijk en snel zou kunnen aantonen?

Ik denk niet dat je dit zomaar voor elkaar krijgt, voor point of care testen wil je gebruik maken van volbloed en Bij gebruik van serum of plasma heb je een centrifuge en nog wat andere spullen nodig.

Voor zover mijn kennis reikt zijn er nog geen methoden ontwikkeld om dit soort enzymmetingen in volbloed te doen.

Mijn kennis reikt inderdaad niet ver genoeg.

Even gezocht en deze link gevonden misschien dat je hier wat mee kunt.

http://www.cholestech.com/docs/test_info/tbALTAST.pdf