sciencetalk

Is er iemand van jullie die iets kent van cDNA-synthese?

Daarbij gebruik je een mastermix en daaraan wordt DTT of dithiotriëtol toegevoegd. Dat is een reducerend agens, het breekt dus zwavelbruggen.

Nu vroeg ik mij af wrm dat wordt toegevoegd aan die mastermix? Om tertiaire van het mRNA te verbreken msh? Hoewel, vormt mRNA S-bruggen dan?

Ik hoop dat iemand mij kan helpen.

Zwitterion

Ik heb even wat gezocht en mijn eigen vermoeden werd deels bevestigd: waarschijnlijk dient het (mede) om de RNAses, die eigenlijk altijd wel aanwezig zijn, te inactiveren. Maar je kunt de discussie hierover hier even nalezen.

Voor zover mij bekend wordt het daar inderdaad voor gebruikt. Ook bijvoorbeeld cRNA probes voor ISH worden vaak 'beschermd' met DTT, waar na synthese van de probe geen enzymen meer voor nodig zijn. Uit mijn hoofd doe ik het zelf met een paar ul 2,5 M: een flinke dosis.

Zoals wordt opgemerkt in de discussie waar Bas naar verwijst zou mercaptoethanol dezelfde functie hebben, hoewel dat een stuk giftiger is dan DTT (en een veel sterkere geur heeft, waar ik zelf echt een hekel aan heb).

Omdat er in principe geen zwavel voorkomt in RNA zou ik er niet van uit gaan dat mRNA een structuur vormt met S-bruggen.

Dus eigenlijk heeft DTT 2 belangrijke functies: destabiliseren van Rnasen en stabilisatie van het reverse transcriptase.

Ik heb ook al hier en daar gelezen dat het secundaire mRNA-structuren zou verwijderen. Maar inderdaad, waar komt die zwavel dan vandaan...

Dus eigenlijk heeft DTT 2 belangrijke functies: destabiliseren van Rnasen en stabilisatie van het reverse transcriptase.

Een reverse transcriptase (RT) is ook een enzym en dus zou ik verwachten dat het net zo als een RNase gedenatureerd wordt DTT.

Dit is echt zo'n voorbeeld waar heel veel mensen heel veel verschillende dingen over zeggen. En niemand lijkt te weten wat nou waar is.. ook dat kan soms bij wetenschap horen.

Het punt is dat ik dat moet weten voor de verdediging van mijn project, als ze mij die vraag stellen. Altijd vervelend als er geen sluitende antwoorden zijn, maar ik kan natuurlijk altijd zeggen dat er discussie over is