Marker/ladder te hoog uitgekomen

[Jamie99]

Goedemorgen beste mensen,
 
Voor biomoleculaire Identificatie hebben we op school een experiment uitgevoerd waarbij we eerst ons eigen DNA hebben geamplificeerd met een PCR, en vervolgens hebben we dit in een 1,5% agarosegel in TAE-buffer 1x gerunned. Na het elektroforeren hebben we met de EZ gel analyser de gek bekeken. Op het scherm bleek toen dat de ladder die we toegevoegd hadden hoger uitkwam dan ALLE monsters (zie bijlage). Dit is simpelweg niet mogelijk omdat we PV92 hebben geamplificeerd, en dit gen is minimaal 416 bp groot.
 
ik zat me af te vragen wat dit heeft veroorzaakt. Ik heb al wel aan bepaalde oorzaken zitten denken, maar ik wil het graag zeker weten zodat ik hieruit iets kan opsteken.
Mijn eigen potentiële foutenbronnen:
- Gel niet lang genoeg gerunned
- Te weinig Volt op de gel gezet
- Gel slecht gekookt (overal witte stippen = verhindert voorttrekking van monsters??)
 
De gebruikte chemicaliën:
-          Agarose
-          SYBR safe
-          100 bp DNA marker (N3231S NEB)
-          Loading dye (4x of 6x)
50 x TAE buffer (voor elektroforese verdund natuurlijk!)
 
 
Bedankt voor het meedenken!
 
Jamie
 
edit: typo's 

[murru]

Hoi Jamie,

Je moet iets meer informatie verschaffen: waar op de gel (welke slotjes) hebben de DNA marker, en welke je PCR reacties?

Naar de gel kijkend, heb je 8 slotjes kunnen gebruiken. Het lijkt het er op dat je van links naar rechts DNA marker in slotje 1 en slotje 8 hebt geload. Verder zie ik DNA bandjes in de lanen die corresponderen met slotjes 4, 5 en 7. Helaas kan je niks zeggen over de de grootte van deze DNA bandjes omdat de DNA marker sterk overbelicht is.

Ik raad je aan om veel minder DNA marker te loaden dan je nu hebt gedaan, zodat het niet zo overbelicht is vergeleken met je DNA bandjes. De witte stippen in de gel zouden eventueel kunnen zijn ontstaan door het te laat toevoegen van je SYBR safe aan je gel na het koken; als de gel al gaat klonteren wordt de SYBR safe niet evenmatig verdeeld.

Als je goed kijkt naar je gel kan het best zijn dat alles prima is gelukt! Je ziet inderdaad DNA bandjes die lager runnen dan je ladder (i.e. lager dan 100bp), maar dit is zeker niet vreemd... Ga maar na, in je PCR reactie, naast het product van 416 bp, welk ander DNA is aanwezig in dit monster...? (hint: je gebruikt het voor de PCR reactie).

Groetjes

[Wouter_Masselink]

Je ladder zit niet te hoog. Je kan zo rond de 400-500 een band in een van je lanes zien zitten. De dunne banden in je PCR zou je ook zien als je een negatieve controle doet zonder sample. Het gaat hier om primer-dimers.

Als je je SYBR safe eerder toevoegt en goed mengt, je ladder op een lagere concentratie op je gel zet, en met een langere exposure, dan zal je je bandjes duidelijk zien.