Fluorescentie

[Stijn6161]

Hallo allemaal

Kan iemand in begrijpbare woorden uitleggen hoe je de DNA concentratie kan bepalen aan de hand van fluorescentie? Ik begrijp deze methode niet echt. Alvast bedankt!

[Gast]

Wat wil je precies weten?

Hoe het globaal werkt staat bijvoorbeeld hier kort uitgelegd:

https://nld.promega.com/resources/pubhu ... na-sample/

Of heel kort:

"Fluorometrische methoden gebruiken intercalerende fluorescerende kleurstoffen die specifiek binden aan dsDNA-moleculen. Fluorometrische instrumenten detecteren fluorescerende signalen van gebonden kleurstoffen en schatten de dsDNA-concentratie ten opzichte van kalibratie reagentia."

Intercalerende stoffen zijn moleculen die gelijken op baseparen en hun plaats innemen in de DNA-helix.

dsDNA is dubbelstrengs DNA.

Een reagens (meervoud: reagentia) is een chemische stof of een mengsel van chemische stoffen dat wordt gebruikt tijdens een chemisch experiment. Vaak worden de termen reagens en reactant door elkaar gebruikt. Dit zijn echter verschillende concepten. Een reagens reageert niet mee tijdens de chemische reactie.

Het betreft iig fluorescentiemicroscopie. Zie bijvoorbeeld:

https://nl.m.wikipedia.org/wiki/Fluores ... bridisatie

Maar er bestaan natuurlijk veel wetenschappelijke artikelen over.

[Marko]

Intercalerende stoffen zijn moleculen die gelijken op baseparen en hun plaats innemen in de DNA-helix.

Ik weet niet waar deze wijsheid precies vandaan komt, maar DNA intercalators nemen zeker niet de plaats in van de baseparen. Ze schuiven er tussen. Daardoor verandert de fluorescentie: deze neemt bij bepaalde golflengtes toe of af, en dat kan gemeten worden (meestal meet je de toename bij een geschikte golflengte).

Het betreft iig fluorescentiemicroscopie. Zie bijvoorbeeld:

https://nl.m.wikipedia.org/wiki/Fluores ... bridisatie

Maar er bestaan natuurlijk veel wetenschappelijke artikelen over.

Fluorescentiemicroscopie is iets heel anders. Ook gebaseerd op fluorescentie maar daarmee heb je de gelijkenis wel gehad. De topicstarter vraagt naar het bepalen van de DNA-concentratie. Dat gebeurt in een meetcel aan een oplossing waar DNA in zit en levert een kwantitatieve bepaling. Flurorescentiemicroscopie is handig voor het in beeld brengen van (onderdelen van) cellen en weefsel, maar is nauwelijks kwantitatief en je bepaalt er zeker geen concentratie DNA mee.

[Gast]

Die wijsheid (beter zou zijn definitie, nietwaar?) komt uit de begrippenlijst hier vandaan:

https://www.studeersnel.nl/nl/document/ ... ie/6239615

Er staat ook niet dat ze de plaats innemen van baseparen, maar hun plaats innemen in de DNA-helix, dat ze er idd tussen schuiven. (Ik wou eerst ook schrijven dat het zich als het ware tussen het DNA materiaal in wurmt, maar naja.)

Maar ik kan me ook wel voorstellen dat dat wel zo opgevat wordt (de plaats innemen van baseparen van het DNA), dus mooi dat je dat even verduidelijkt.

En over je laatste paragraaf:
Ok, bedankt. (Hopelijk ook namens Stijn6161.)

[Marko]

Die wijsheid (beter zou zijn definitie, nietwaar?) komt uit de begrippenlijst hier vandaan:

https://www.studeersnel.nl/nl/document/ ... ie/6239615

Er staat ook niet dat ze de plaats innemen van baseparen, maar hun plaats innemen in de DNA-helix, dat ze er idd tussen schuiven. (Ik wou eerst ook schrijven dat het zich als het ware tussen het DNA materiaal in wurmt, maar naja.)

In de tekst die je letterlijk (en zonder bronvermelding) overnam wordt met geen woord gerept over er tussen schuiven of wurmen. Hoe moet je "hun plaats" dan anders interpreteren dan als "de plaats van de baseparen"?

Ik denk dat

https://en.wikipedia.org/wiki/Intercala ... chemistry)

als bron een stuk geschikter was geweest. Daar staat ook netjes schematisch weergegeven wat er gebeurt.

Maar dan moet je het natuurlijk wel eerst door Google Translate halen.

[Gast]

Maar dan moet je het natuurlijk wel eerst door Google Translate halen.

Ja, als je geen Engels kan wel. Ik hoop dat de TS hier enorm veel aan heeft .

[Marko]

Voor de volledigheid de bronvermelding:

https://thesequencingcenter.com/knowled ... c-methods/

[Gast]

Ok, hartelijk dank voor de hulp Marco.

[Stijn6161]

Dag heren, bedankt voor de uitleg. Klopt het dat de kleurstof die tussen het DNA zit dan door de golflengte naar een hoger niveau gaat om nadien terugtevallen naar het de gewone schil Bij deze terugval komt licht vrij dat gemeten kan worden?

[Marko]

Dat is inderdaad het principe achter fluorescentie. Misschien goed om daar nog 1 ding aan toe te voegen: bij de absorptie gaat het molecuul in 1 keer naar een (veel) hoger energieniveau. Het terugvallen gebeurt meestal in een paar stappen, kleinere stappen dus, met een kleiner energieverschil. Het licht dat wordt uitgezonden heeft daardoor een andere (langere) golflengte dan het licht dat is geabsorbeerd.

Was dat niet het geval, dan zouden absorptie en emissie bij dezelfde golflengte gebeuren, en dan meet je niks - want wat eruit komt is dan hetzelfde als wat erin gaat.

Zie dit plaatje, afkomstig van https://en.wikipedia.org/wiki/Fluorescence:

[Stijn6161]

Duidelijke uitleg! Hoe geraakt het molecule dan in een hoger energieniveau?

[Marko]

Door het absorberen van licht. De golflengte van dat licht hangt samen met de energie die de fotonen hebben. Door het opnemen van een foton ontvangt molecuul precies die energie die nodig is om van het ene naar het andere niveau te gaan.

Of omgekeerd: de energie van het foton dat wordt geabsorbeerd bepaalt op welk niveau je (vanuit de grondtoestand) precies terecht komt.

[Stijn6161]

is dat bij DNA dan altijd 260 nm?

Indien dit me gevraagd wordt : kan ik dan antwoorden :
Er is een fluorescerende component die tussen het dsDNA kan binden. Door licht geraakt de fluorofoor in aangeslagen toestand. Bij de terugval komt licht vrij. Dat kan gemeten worden en door het resultaat te vergelijken met de standaard kan bepaald worden wat de concentratie is?

Sorry voor alle vragen, ben niet zo thuis in dit onderwerp