Mutaties

[spark]

Voor een project wil ik graag een mutatie sequencen van het curly-gen bij Drosophila en deze vergelijken met het wild-type cy gen. Het gen zelf is te groot om volledig te sequencen en ik wil dan ook de specifieke locatie achterhalen. Zoekpogingen op flybase, OMIM (ncbi) en diverse artikelen hebben tot nu toe geen succes, iemand nog een idee?

[Dalton]

Heb je de sequentie van het gen?

En weet je waar de mutatie zit?

De sequence primer kan je bijna overal maken dus dan neem je gewoon een stukje vlak voor de mutatie.

[spark]

Heb je de sequentie van het gen?

En weet je waar de mutatie zit?

De sequence primer kan je bijna overal maken dus dan neem je gewoon een stukje vlak voor de mutatie.

Dalton, het is inderdaad onze bedoeling om specifiek het stuk met de mutatie te sequencen (dus met primers vlak voor en na de mutatie). De sequentie van het gen is bekend en dus beschikbaar (van D. melanogaster is het complete genoom in kaart gebracht), maar ik weet niet waar in dat gen de mutatie zich bevindt en dat is dan ook het probleem.

[Dalton]

[Identification of a common deletion in different curly mutants in Drosophila melanogaster]

[Article in Chinese]

Li HW, Lian LS, Zhao CJ, Bai LH, Deng XM, Wu CX.

College of Animal Science and Technology, China Agricultural University, Beijing 100094, China. [email protected]

Curly is a easily distinguishable dominant mutant wing character. The Cy mutation is the most commonly used dominant marker for the second chromosome balancers in Drosophila melanogaster, but little is known about the Cy gene. Based on known genomic and cytogenetic information, a 102 bp deletion which is located between the Genes synaptotagmin (syt) and Activin Like Protein at 23B(Alp23B) on the Drosophila melanogaster genome (release 4) had been found to be commonly contained on Cy chromosome in three different curly strains. Meanwhile, when using the deletion as a DNA marker, the result suggested that Cy homozygote be lethal in embryo period. These results will provide some helpful information to investigate molecular mechanism of curly wings in the further study.

Meer kan ik helaas ook niet vinden.

[Wouter_Masselink]

Je zou meerder sequencing reacties uit kunnen voeren waarbij je telkens een gedeelte overlap tussen je verschillende regios laat bestaan.

[spark]

Je zou meerder sequencing reacties uit kunnen voeren waarbij je telkens een gedeelte overlap tussen je verschillende regios laat bestaan.

Het is een schoolproject waarbij geld en tijd altijd een rol speelt, helaas dus geen optie. Ik ga verder zoeken in de hoop iets bruikbaars tegen te komen. Bedankt voor de hulp in ieder geval.

[Wouter_Masselink]

Als het hier gaat om deleties, dan zou je alternatief kunnen kijken naar de locatie door een reeks verschillende PCRs te doen en afgaande op de grootte van het fragment voorspellen waar je mutatie zit.

Veel succes in de literatuur.

[spark]

Het is inderdaad een idee om het complete gen te PCRen en adhv een restrictiedigest te achterhalen in welk deel de mutatie zich bevindt. Zoals je zegt moet het dan wel een deletie of insertie betreffen.

[Wouter_Masselink]

Dat is altijd een mogelijkheid. Mijn voorstel is echter iets anders. Door een reeks verschillende primers te gebruiken kan je hetzelfde effect verkrijgen met meet duidelijkheid. Tevens kan je deze zelfde primers vervolgens gebruiken om de specifieke regio te sequencen.

[Themisto]

Het voorstel van Wouter_Masselink is een veelgebruikte manier om dit te doen en hoeft helemaal niet zo tijd consumerend te zijn (mits je beschikt over een genetic analyzer die meerdere capillairen tot beschikking heeft). Je ontwerpt je primers zodoende dat je amplicons elkaar gedeeltelijk overlappen, runt deze in dezelfde PCR (wel verschillende PCR cupjes), controleert op gel en vervolgens sequence je ze in afzonderlijke sequencing reacties (hou rekening dat je zowel forward als reverse moet sequencen, dus twee sequencing reacties per amplicon). Hoeveel reacties je tegelijk door de analyzer kan laten gaan is afhankelijk van het beschikbare aantal capillairen. En het aantal amplicons dat je nodig hebt om je gen te analyseren op mutaties is afhankelijk van of je mutaties wilt detecteren in exonen en/of intronen (als je alleen exonen wilt analyseren kan je namelijk cDNA maken m.b.v. Reverse Transcriptase - PCR op mRNA, wat aanzienlijk korter is dan genomisch DNA) en de lengte van je gen. Of ben je op zoek naar een specifieke mutatie op een specifieke plek? In dat geval volstaat een PCR om het gedeelte te amplificeren waarin die mutatie zich bevind en daarop te sequencen.