Knockout muizen

[biologiestudent]

Ik ben helemaal niet mee met het genotype van de knockout muizen..

Ik begrijp dat er embryonale stamcellen (die een gen van interesse en een selectiemerker bevatten) worden ingeplant in de blastocyste van een draagmoedermuis. Maar dan..

Stel, je ent ES-cellen van een bruine muis, homozygoot voor vachtkleur en heterozygoot voor gen van interesse

(A/A; X+/X-) in in de blastocyste van een zwarte muis, homozygoot voor beide genen (a/a; X+/X+)

Hoe krijg je hieruit dan een knockout muis? En waarom moeten nockoutmuizen homozygoot zijn?

alvast bedankt

[Sjitty]

Met KO muizen wil je dus bereiken dat een bepaald gen volledig uitgeschakeld is. Daarom moet de muis dubbel negatief (m.a.w homozygoot voor het defecte allel) zijn voor dat gen, zodat geen werkend gen aanwezig is.

Je wil dus een muis dat X-/X- is in alle cellen.

Een belangrijke restrictie bij het maken van transgene ES-cellen is dat slechts één gen-disruptieplasmide per cel mag geïntegreerd worden. Dat wil zeggen dat men dus maximaal X-/X+ kan bekomen na transfectie. Om X-/X- te bekomen moet men dus selectief gaan kruisen.

Men begint met het injecteren van A/A, X-/X+ ES-cellen in de blastocyst van a/a X+/X+ ES cellen. Hieruit ontstaan chimere muizen (chimere muizen hebben 2 verschillende celpopulaties die verschillen in genotype). Dit kan je duidelijk zien a.d.h.v het chimere vachtpatroon (bruin EN zwart).

Deze chimere muizen gaat men selecteren, in de hoop dat er ook A/A, X-/X+ cellen onder de kiemcellen (en zo A,X- gameten mogelijk zijn) aanwezig zijn. Deze kunnen namelijk na kruising met a/a, X+/X+ aanleiding geven tot volledig bruine muizen, namelijk A:A, X+/X+ of A/a, X-/X+. Deze laatste is nu dus een muis die heterozygoot is in alle cellen (in tegenstelling tot de chimere muizen die slechts gedeeltelijk je gen van interesse kwijt zijn) voor jouw gen van interesse. Dat is al een goede start.

Nu ga je die bruine muizen gaan screenen op DNA niveau (DNA op een gel laden) om de X-/X+ te gaan onderscheiden van de X+/X+ (deze kan je niet gebruiken)

De X-/X+ gaje nu onderling gaan kruisen. Onder de nakomelingen zal mogelijks een X-/X- muis te vinden zijn, je gewenste KO muiz. Je moet hiervoor opnieuw screenen, want van buiten af zijn ze niet te onderscheiden.

PS: Studeer je aan de Ugent? Je vragen volgen namelijk verdacht veel de volgorde van een cursus die ikzelf liggen heb Lijkt wel of je net begint te studeren voor examen Celbiologie

[biologiestudent]

Bedankt voor de uitleg!

Ik ben inderdaad aan het studeren voor het vak Celbiologie, 2de bachelor Biologie aan de Ugent. Wat een rotcursus..

Wat is een disruptieplasmide juist?

En nu ik toch bezig ben met vragen stellen, in het stuk hiervoor gaat het over positieve en negatieve selectie. Wat is de reden dat er nog eens een negatieve selectie wordt toegepast na positieve selectie?

[Wouter_Masselink]

wat is het verschil tussen positieve selectie en negatieve selectie, wanneer is de kans op fout positieven en fout negatieven het grootst?

[biologiestudent]

Ik wil wel een poging doen maar ik weet niet of mijn uitleg klopt:

Positieve selectie bevordert de aanwezigheid van een bepaald kenmerk. Als je bijvoorbeeld het gen neoR transfecteert in een muis dan kan je de genotypische veranderingen ook volgen in het fenotype. Selectie voor dit gen kan je dan doen op een G418 medium.

Een negatieve selectie heeft juist een slechte invloed op het organisme (bv/ het HSVtk gen). Deze genen worden dus best uit het genoom gehaald.

Dus: als je een homologe recombinatie uitvoert, wil je dat de positieve merker nog in het gen aanwezig is en dat de negatieve merker eruit wordt gehaald. Maar het zou kunnen dat je met een foutieve recombinatie te maken hebt waardoor het negatieve gen er nog steeds in zit. Dus moet je eerst selecteren voor het positieve gen en erna nog eens voor het negatieve selectie om er zeker van te zijn dat je geen negatieve genen in je draagmoedermuis zal inspuiten?

[Sjitty]

disruptieplasmide

Plasmide die een construct bevat die jouw gen van interesse kan gaan uitschakelen (disrupteren) in het genoom van de getransfecteerde cel. Met als gevolg bijvoorbeeld het vervangen van het gen door een stuk van je construct (die niet functioneel is, althans niet de functie van het oorspronkelijke gen) door homologe recombinatie.

[Sjitty]

Ik wil wel een poging doen maar ik weet niet of mijn uitleg klopt:

Positieve selectie bevordert de aanwezigheid van een bepaald kenmerk. Als je bijvoorbeeld het gen neoR transfecteert in een muis dan kan je de genotypische veranderingen ook volgen in het fenotype. Selectie voor dit gen kan je dan doen op een G418 medium.

Een negatieve selectie heeft juist een slechte invloed op het organisme (bv/ het HSVtk gen). Deze genen worden dus best uit het genoom gehaald.

Dus: als je een homologe recombinatie uitvoert, wil je dat de positieve merker nog in het gen aanwezig is en dat de negatieve merker eruit wordt gehaald. Maar het zou kunnen dat je met een foutieve recombinatie te maken hebt waardoor het negatieve gen er nog steeds in zit. Dus moet je eerst selecteren voor het positieve gen en erna nog eens voor het negatieve selectie om er zeker van te zijn dat je geen negatieve genen in je draagmoedermuis zal inspuiten?

Inderdaad. Alhoewel dat de bezorgdheid niet echt ligt bij het aanwezig zijn van een "negatief" of gevaarlijk gen, maar uit de noodzakelijkheid dat 2 maal homologe recombinatie optreed, vóór en achter je gen van interesse zodat alle DNA achter dat gen terug op zijn plaats ligt. Indien enkel recombinaite vóór het gen gebeurt, ben je alle DNA achter je gen van interesse kwijt. (maar dit bedoelde je waarschijnlijk met "foutieve recombinatie". Met die negatieve selector, die achter je disruptiegen geplaatst is, die in dat geval ook in het genoom ingebouwd blijft, kan je deze cellen laten afsterven.

Het gaat dus niet echt om de aanwezigheid van dat gen, maar de reden waarom dat gen er nog in zit.

Ik denk wel dat je dit bedoelde, maar voor alle zekerheid

[Sjitty]

Als ik je nog een tip mag geven, spendeer nie tte veel tijd aan dat eerste hoofdstuk, zorg gewoon dat je het begrijpt, maar niet van buiten kent. De andere hoofdstukken zijn veel belangrijker en meer werk om van buiten te leren (al die eiwtten en genen), met in het bijzonder, "proto-oncogenen vs tumor-suppressor genen", in het extra bijzonder alles rond p53 . De Prof. houdt van p53

[biologiestudent]

Indien enkel recombinatie vóór het gen gebeurt, ben je alle DNA achter je gen van interesse kwijt.

Als er enkel recombinatie voor je gen optreedt, ben je dan je gen zelf ook niet kwijt?

En wat is nu juist het nut van zo een negatieve selectiemerker? Die zorgt er dus voor dat, als je met maar 1 homologe recombinatie zit (i.p.v. de noodzakelijke 2 recombinaties), alle genen die achter het gen van interesse zitten weer verdwijnen? Ik denk dat ik nog steeds niet echt goed mee ben...

Alvast super bedankt!

Prof. houdt van p53

Ik heb geen cursus van dit vak, enkel slides. Daarom dat ik het zo moeilijk vindt het vak te studeren. En spreken we wel over dezelfde prof? G Berx en J. Van Hengel?

[Sjitty]

Hmm nee, bij mij is het van F. Van Roy en J. Van Hengel maar het zijn zeker dezelfe slide, die werken samen. Maar dan toch een andere cursus in het geheel (met cursus bedoel ik hier wel slides ja )

hier een verduidelijking:

[biologiestudent]

Ok, super, dat snap ik ondertussen.

Hechten ze veel belang aan het Cre-Loxp systeem? Want ook dat snap ik niet echt goed..

[Sjitty]

in deze late fase (net voor het examen) zou ik alles wat je echt niet snapt even overlaten en focussen op de rest. Ik vermoed niet dat ze geen grote theoretische vraag zullen stellen over Cre-LoxP systeem maar het is wel een veel gebruikt systeem en daarom dus wel belangrijk dat je het ooit gaat snappen . Ik weet natuurlijk niet wat je andere hoofdstukken zijn (vooral weefselleer gok ik dan?). Smijt je maar op de theoretische. Soms heeft het geen nut om te staren op zon dingen, maar komt de clue pas later wanneer je er toevallig over nadenkt buiten het studeren.

En probeer toch zelf nog even na te denken voor je systematisch alle vragen op het forum gaat smijten, dan ga je zelf ook meer onthouden

Ik ga nu ook gaan verder blokken! Succes. Ik kijk vanvond hier nog eens als je echt iets nog niet snapt en er nog niemand anders geantwoord heeft.

[biologiestudent]

Er is een simpeler theoriestuk in aantocht cytoskeletten

Hartelijk bedankt voor de uitleg! En ik post enkel iets als ik er al veel te lang op zit te staren.

U ook nog veel succes

[Wouter_Masselink]

Probeer je vragen wel zo veel mogelijk op onderwerp te sorteren en van dit topic dus niet een vergaarbak te maken. Succes met studeren!