piek komt bijna onvertraagd

[Uncle Paulie]

Hallo,

Aangezien ik geen ''stel jezelf hiervoor'' topic ben tegengekomen schiet ik er hier maar meteen op los 8-[ .

Ik ben een HPLC analyse aan het opzetten voor een component met de bruto structuurformule C12H11N7 (3 ringen waarvan 2 met aminegroepen en stikstof in de ring).

Ik gebruik hiervoor een C18 kolom, nu elueert deze piek al binnen 2 minuten (flow 1ml/min) bijna onafhankelijk van de acetonitril concentratie (50%ACN tr=2 min ; 15%ACN tr=3min). Ik heb nog een CN kolom gevonden (uit 1994!! ) maar ook hierbij geen verschil, al zegt dit misschien meer over de kolom. Veranderen van de pH van het eluens heeft ook geen effect.

Iemand nog een suggestie wat ik kan doen om wat extra selectiviteit te verkijgen ?

alvast bedankt!

[JeroenCV]

Hoi Paulie,

Het stel je voor zit in de chillout en heet "dag dag"

Je zou ten eerste eens een nieuwe C8 kolom kunnen proberen.

Wat is de pH van je eluens? Wat is er behalve de ACN% aanwezig in je eluens? Waarin is je monster opgelost?

[Napoleon1981]

Deze stof moet te scheiden zijn op een c18 kolom. Wat is de pH van de mobiele fase?

Je kunt ook een phenyl kolom proberen als je die hebt, al zal je daar wel een behoorlijke retentie gaan krijgen met die lone pairs op de stikstof atomen en de pi paren in de ringen.

edit: Jeroen was me voor , maar ben het niet eens met een c8 kolom als de vraagsteller al geen retentie krijgt op een c18 kolom. Maar zoals jeroen ook al zei, de pH zal hier belangrijk zijn.....

[rage against the machine]

temperatuur ook, maar wel minder van belang dan pH

[Napoleon1981]

Temperatuur dus niet, de vraagsteller vraagt om selectiviteit.... De selectiviteits factor veranderd nauwelijks met temperatuur.

[rage against the machine]

"Bij HPLC is de retentietijd van de componenten natuurlijk zeer belangrijk.

Als vuistregel kan je stellen dat de retentietijd met 1 Ã 3 % daalt bij een temperatuurstijging van 1 °C. Dit heeft ook een invloed op de selectiviteit, maar die is niet echt voorspelbaar.

In laboratoria waar reproduceerbaarheid zeer belangrijk is, zal men de kolom steeds thermostatiseren op 30 Ã 40 °C."

Van een ander topic: klik

maar niet echt voorspelbaar

[Uncle Paulie]

bedankt voor de antwoorden tot dusver

pH van het eluens en het monster zijn 3.5

eluens pH van 8.5 leverde niets op...viel me wel net in dat ik de standaard toen niet aangepast heb dus die heb ik zojuist even ingezet met pH8.5 (momenteel niet gebufferd omdat er geen matrix is).

(pKa van de stof is 6.2)

[Uncle Paulie]

"Bij HPLC is de retentietijd van de componenten natuurlijk zeer belangrijk.

Als vuistregel kan je stellen dat de retentietijd met 1 à 3 % daalt bij een temperatuurstijging van 1 °C. Dit heeft ook een invloed op de selectiviteit, maar die is niet echt voorspelbaar.

In laboratoria waar reproduceerbaarheid zeer belangrijk is, zal men de kolom steeds thermostatiseren op 30 à 40 °C."

Van een ander topic: klik

maar niet echt voorspelbaar

Goede muzieksmaak my all time favourite.

temperatuur van je analyse doet echter eigenlijk niets met je selectiviteit, het is een handig middel om al je pieken naar voor of naar achter te schuiven of als de druk van je systeem tegen zijn max aanzit of als je echt de puntjes op de i wilt zetten 8-[

[Jeroen_CF]

Wat is de matrix waarin je monster zich bevind? Hoeveel selectiviteit heb je nodig dan?

Al eens met methanol gewerkt (heeft wel een nadelige invloed op je druk en je UV cutoff....)

Jeroen.

[Napoleon1981]

"Bij HPLC is de retentietijd van de componenten natuurlijk zeer belangrijk.

Als vuistregel kan je stellen dat de retentietijd met 1 Ã 3 % daalt bij een temperatuurstijging van 1 °C. Dit heeft ook een invloed op de selectiviteit, maar die is niet echt voorspelbaar.

In laboratoria waar reproduceerbaarheid zeer belangrijk is, zal men de kolom steeds thermostatiseren op 30 Ã 40 °C."

Van een ander topic: klik

maar niet echt voorspelbaar

@rage: Waarom het gedaan wordt is mij duidelijk. De selectiviteits factor veranderd echter echt niet hoor. Kijk maar eens hoe deze berekend word. Als jij mij een formule kunt geven waaruit blijkt dat dit wel zo is sta ik hier voor open.

@ vraagsteller, weet je zeker dat de pKa van beide aminen zolaag is? Je zult inderdaad beide groepen moeten proberen te deprotoneren. Met een pH van 3.5 is de lading +2 en dat wel erg veel voor een klein molecuul als dit op een RP-kolom. Wanneer de pKa echt in de buurt ligt van de 6.5 zul je met 8.5 genoeg retentie moeten krijgen.... Zeker op een lage concentratie organisch

[Uncle Paulie]

matrix zal geen probleem worden, UV cut-off ook niet.

probleem is dat ik wel een afbraakpruduct heb met nagenoeg dezelfde retentie, pieken overlappen. Doordat de piek nagenoeg onvertraagd voorbij komt plus dat mijn acetonitril weinig tot geen invloed heeft hou ik weinig speelruimte over om er iets aan te doen.

MeOH nog niet geprobeerd.

@napoleon1981. Heb net de run met pH8.5 bekeken, Tr=2.8min.

Het gaat allemaal een beetje tegen de logica in, daarom zal ik morgen het eluens eens verversen, misschien dat daar het probleem ligt.

[Napoleon1981]

Ja precies,

Hoe ziet je piek vorm er uit? Zijn je drukken normaal? Anders eens een phenyl kolom proberen zoals ik eerder al zei, maar ik vind het echt heel vreemd. Lijkt bijna wel of je systeem niet naar behoren functioneerd.

[Jeroen_CF]

Voer je een isocratische of gradientelutie uit?

Weet uit ervaring dat dit nog wel eens een relatief groot verschil kan maken. In ieder geval soms genoeg om twee pieken basis van elkaar te scheiden.

Heb je ook al gekeken om bij een andere golflengte te meten?

Misschien absorbeert je afbraakproduct bij een andere golflengte.

Wat voor detectie gebruik je eigelijk? UV/VIS vast of variabel (Photo diode array)?

Groeten,

Jeroen.

[JeroenCV]

Ik heb het nog allemaal zitten overlezen en denk dat je een ander probleem hebt dan wat je met veranderingen aan eluens kan oplossen.

Wat ook Napoleon zegt, wat is de druk van je systeem? klopt je flow? Hoe is je piekvorm.

Maar wat is je detectie methode? UV of MS?

Heb je andere standaarden al geinjecteerd op dit zelfde systeem? heb je dan wel retentie?

[Uncle Paulie]

Ben ik weer...

Ik heb nieuw eluens gemaakt maar dit gaf ook geen verandering.

Het systeem wordt ook gebruikt voor routine analyse met dezelfde kolom (alleen iets ander eluens) waarbij ik geen onregelmatigheden gezien heb.

Omdat ik vooral aan het zoeken ben geweest naar een juiste eluensverhouding heb ik nog niet echt gevoel voor wat de druk precies zou moeten zijn. De druk is in de grootte die ik verwachtte ahv andere analyses, de druk is niet zo laag dat er (bijna) alleen acetonitril verpompt zou worden wat de korte Tr zou kunnen verklaren.

Ik gebruik een DAD als detector en de pieken zijn symmetrisch.