HPLC IJklijn

[harriel]

Hallo,

We maken bij ons voor ieder analyse gericht op een bepaalde component een drie puntige ijklijn.

Dit zijn de 3 punten op 50% en 100% en 150% van de richtwaarde.

Nu kun je handmatig een extra punt toevoegen aan de ijklijn.

Stel ik heb een goed ijklijn op basis van die 3 punten. Als ik nu handmatig een punt aan deze ijklijn toevoeg met amount nul en area van nul en de ijklijn blijft goed heb ik dan het bewijs geleverd dat de lijkijn doorgetrokken kan worden in het gehele gebied onder de ijklijn dus tot een amount van nul??

Als dit zo is en ik weet dit van een bepaalde component dus dat de ijklijn door nul gaat dan kan ik als ik een slechte ijklijn van 3 punten heb dit nulpunt gebruiken om te bepalen welke van de 3 punten mischien niet goed is geweest!

Klopt deze redenering?

Groetjes Harrie

[Napoleon1981]

Nee dat mag niet. Het hangt natuurlijk allemaal af van de fout die je voor lief wilt nemen. In de farmaceutische business moet met vaak over 3 orders of magnitude calibreren. Dit gebied wordt dan minstens door 5 standaarden afgebakend.

Je calibreerd wel over een heel erg klein gebied. Soms zijn calibratie curves kwadratisch wanneer je adsorptie hebt en noem maar op, ook hier hou je geen rekening mee als je meteen naar de oorsprong springt.

[harriel]

Hallo,

We hebben nu een 5-puntige ijklijn gemaakt. Deze wordt door de software beoordeeld als R=0,999934 Dit vinden wij in pricipe een erg goede ijklijn.

Nu blijkt bij nadere bestudering van deze ijklijn deze in het onderste gebied, wel binnen deze ijklijn toch een afwijking te hebben van zo'n 2,5% van de waarde welke het zou moeten zijn. Dit is toch een redelijk grote afwijking.

Hoe beoordeel je eigenlijk een ijklijn of die goed is. Blijkbaar niet door alleen deze op de R te beoordelen.

Groetjes Harrie

[Fuzzwood]

Ah, nu ontdek je het effect van gevoeligheid.

[Derrek]

De R² -die je waarschijnlijk hebt berekent in Excel- zegt weinig over de "pure error". Het zegt meer dat de respons linear stijgt. Zo kan je een R<sub>2 uitkomen die 1 benadert, maar toch zien dat er individuele metingen sterk afwijken van de trendlijn.

Ik weet niet echt met wat voor soort metingen je werkt, maar ik zou meerdere metingen in hetzelfde punt uitvoeren.</sub>

[kaadeekaa]

Voor de goede orde: een R² wordt ook altijd gegeven in de software van de LC .

Een ijklijn met een R² van 0,999934 is echt wel een behoorlijk goede ijklijn, om niet te zeggen praktisch perfect voor een HPLC-systeem. Vandaar dat ik denk dat je de ijklijn ook doet met standaarden die geen voorbehandeling hebben gehad en ook geen storende achtergrond heeft (hoe klein ook).

Voor de rest zegt een ijklijn niets over de accuraatheid van je meting, maar wel iets over de precisie ervan. Het verschil is dat je heel precies kan werken volgens je ijklijn (hoge precisie), maar dat je telkens een systematische fout maakt van bijv. 2% (lage accuraatheid).

Dit bekom je meestal als je een ijklijn opstelt met gewone standaarden en je dan je stalen injecteert waarop je eerst enkele voorbehandelingen of verdunningen op hebt gedaan. Overal kunnen systematische fouten optreden, vanaf het moment van staalname tot de injectie zelf.

Hoe je dat kan vermijden is door bijv. een blanco staal te doperen (spiken) met een gekende hoeveelheid van je te bepalen componenten. Je kan dit doen met 3 blanco's en dan 3 verschillende % van spiking. En je behandelt deze stalen dan net zoals je onbekende stalen behandelt. Zo heb je een ijklijn die relatief dezelfde fouten in zich meedraagt als een onbekend staal. Gevolg: met een goeie chromatografische methode en een goeie LC, krijg je een heel mooie precisie en goede accuraatheid. (tenzij je natuurlijk random fouten maakt, maar dan moet er bekeken worden waarom je deze fouten maakt. Kan aan opleiding liggen, omgevingsomstandigheden, ...)

[Napoleon1981]

2.5% is een mooie waarde vind ik hoor. Een ijklijn is het gevoeligst in het midden van de lijn. De fout neemt toe aan de uiteinden van je calibratie lijn.

http://meloun.upce.cz/docs/datasets/132/fig3.jpg

Zie de stippellijn.

Omdat jij kennelijk aan het lage einde zit kun je beter hoge punten weg laten en meer punten in het lage gebied gebruiken zodat je weer in het midden van je lijn komt te zitten. Maargoed als je erg laag gaat meten neemt je fout altijd toe, dit komt omdat je signal to noise omlaag gaat, en hier komen de termen: limits of detection, limits of quantitation etc vandaan. Deze termen kun je zelf berekenen op de fout die jij nog acceptabel vind.

[harriel]

Hoi,

Inderdaad komt nu bij ons de termen: limits of detection, limits of quantitation aan de orde.

Dit omdat wij metodes aan het valideren zijn. Bij onze gebruikelijke analyse meten wij niet in dit lage bebied.

Nu vinden we bijvoorbeeld bij de quantficatie limiet(5x signaal/ruis verhuoding) een amount die 300 keer hoger is als zijn berekende waarde.

Dit komt dus door de fout in de ijklijn.

Mij lijkt dat je bij een goede kwantificatie limiet de juiste waarde moet vinden.??

[Napoleon1981]

Ik snap je niet?

Zijn berekende waarde? wie? Probeer je een publicatie na te bootsen?

Misschien is je detector wel veel minder gevoelig, of geeft veel meer ruis.

[harriel]

Met de berekende waarde bedoel ik de waarde (ppb) van een oplossing die je maakt op het kwantificatie nivo.(5 keer de ruis).

Als je die waarde dan vergelijkt welke uit de meting volgt.

[Napoleon1981]

Ah ik snap je nu denk ik Moest er even over nadenken hoor

Ja bedenk maar eens wat er gebeurd als je ijklijn niet door de oorsprong gaat als je dit doet.

[harriel]

Sorry dat ik de vraag niet altijd even duidelijk stel.

Ja inderdaad Napoleon dan zit je er zo maar een factor 300 naast!!

Maar hoe bepaal ik dan het kwantificatie limiet.????

Mij lijkt dat je je bij een kwantificatie limiet de berekende waarde in je oplossing met de HPLC moet kunnen vinden.

[Napoleon1981]

Maak eens een calibratie lijn in de buurt van de kwantificatie limiet en bepaal het dan.

[harriel]

Maar als ik methode moet valideren welke kwantificatie limiet wordt er dan gevraagd ( Door evt inspecties )

Die van 5 keer de ruis en moet je die dan ook echt kunnen kwantificeren. Dan moet er dus een ijklijn gemaakt worden in dit extreem lage gebied.

Of mag je dan een stuk hoger meten, bijvoorbeeld 20% van je richtwaarde.

Met richtwaarde bedoel ik de amounts waarop de eindoplossingen ngemaakt worden.

[Napoleon1981]

Je zult eens wat moeten gaan lezen hierover.

http://www.springerlink.com/content/y08q24...43/fulltext.pdf

Dit is een goed begin.

Let op ze bespreken oa ook waarom het fout gaat bij een photodiode array detector die ze gebruiken.