Lagere yield bij hogere concentratie reagens

[IronMan2]

Ik ben bezig met een bepaling voor topiramaat (TPM) op te zetten. TPM wordt gederivatiseerd met NBD-Cl om dit te kunnen detecteren met HPLC-FLD. Amlodipine wordt als interne standaard meegenomen (die reageert ook met NBD-Cl).

Nu ben ik bezig met de optimalisatie van mijn NBD-Cl concentratie. Je verwacht dat bij een grotere overmaat aan NBD-Cl meer TPM en I.S. zal reageren. Bij de I.S. zie je ook een stijgende grafiek, maar bij TPM zie je de piekoppervlakte af nemen.

Mijn vraag is hoe dit kan? Mijn eerste gedachten was het volgende: NBD-Cl kan met OH- reageren, bij een hogere concentratie NBD-Cl zal hierdoor de pH dalen. Door de lage pH kan TPM niet meer goed reageren en neemt de omzetting af. Nu heb ik de molariteit van mijn buffer verdubbeld, maar dit gaf nog steeds een dalende grafiek.

Werkwijze:

• 2,5 ml organische fase (extractie) wordt ingedampt

• Het residu wordt opgelost in 100 µl NBD-Cl (fluorescentie reagens), 100 µl dichloormethaan en 25 µl boraat buffer (pH 10,6).

• De monsters worden 10 sec gemengd op de vortex en dan over gepipetteerd in vials.

• Deze worden 30 minuten verwarmt bij 60oC

• De vials laten afkoelen en meten met HPLC-FLD.

[Epyon]

Mijn eerste gedachten was het volgende: NBD-Cl kan met OH- reageren, bij een hogere concentratie NBD-Cl zal hierdoor de pH dalen. Door de lage pH kan TPM niet meer goed reageren en neemt de omzetting af. Nu heb ik de molariteit van mijn buffer verdubbeld, maar dit gaf nog steeds een dalende grafiek.

Maar met hoeveel is de hoeveelheid NBD-Cl toegenomen?

Misschien is het handiger om eerst een reeks (van verschillende NBD-Cl concentraties) te doen met een vaste buffer concentratie en dan een reeks te doen met b.v. dubbele bufferconcentratie.

Dan zie je denk ik snel of het moment waarop de intensitieten afnemen in beide gevallen hetzelfde zijn of verschillen. Als ze verschillen dan zou dat kunnen duiden dat bij een hoger hoeveelheid NBD-Cl de buffer niet genoeg kan bufferen.

Zo denk ik tenminste dat je dan kan zien of het komt door je buffer of niet.

[mmaarr]

een optie kan zijn om de temperatuur lager te kiezen, bv 40°C gedurende 30 minuten.

kan me herrineren dat na de derivatisering de pH werd verlaagd, weet dit niet meer zeker.

Verder zou je de pH van de buffer bij de derivatisering ook eens bij andere pH kunnen proberen.

[IronMan2]

Ik heb ook gemeten met een constante buffer concentratie bij verschillende concentraties NBD-Cl. Bij TPM zie je een dalende en bij de I.S. een oplopende grafiek.

Vandaag ga ik dit nog een x doen maar dan met een sterkere buffer. Laat het resultaat hiervan binnenkort weten.

Mijn volgende stappen zijn het optimaliseren van de pH, temperatuur en tijd. Het aan zuren heb ik ook ergens gelezen. Dit is om het hydrolyse product van NBD-Cl (NBD-OH) af te breken, om zo een hogere gevoeligheid te krijgen.

Het probleem is denk ik het volgende: TPM kan alleen met NBD-Cl reageren in een alkalisch milieu. NBD-Cl reageert eerder met OH- dan met de stikstof van TPM. Dus in een alkalisch milieu reageert OH- met NBD-Cl, hierdoor daalt de pH en zonder een alkalisch milieu reageert TPM niet.

[Epyon]

Misschien zou je ook de pH kunnen meten ervoor en erna om te kijken of je pH veranderd ?

Dan weet je het direct

[IronMan2]

Ik heb de pH gemeten met pH papier, want er is maar 225 ul aan reactievolume (dus niet met een elektrode mogelijk). Hierbij zag je wel een verandering in pH.

De resultaten van de sterkere buffer zien er goed uit. Mijn TPM piek is veel groter (>9x). Je ziet nog wel dat de pH afneemt bij toename van NBD-Cl. Zit nu bijna tegen de maximale oplosbaarheid van borax aan, dus de concentratie kan niet veel hoger. Ik kan wel meer buffer toevoegen.

Mijn I.S. geeft een vergelijkbare grafiek als met de lagere buffer concentratie. Hoe kan het dat de pH weinig invloed heeft op de reactie van de I.S. (primair stikstof) met NBD-Cl?

[Napoleon1981]

http://www3.interscience.wiley.com/journal...ETRY=1&SRETRY=0

Heb jij wel eens een gradient elutie gedraaid? Hoeveel pieken zie je dan?

Als ik dat artikel lees dan kan ik me voorstellen dat je nog wel eens ander product kan vormen dan wat de standaard analytische chemist verwacht.

[IronMan2]

ik ben er achter waarom mijn I.S. een slechte reproduceerbaarheid heeft. wanneer je namelijk het reagens al hebt toegevoegd gaat deze al meteen reageren, maar wanneer je de buffer toevoegt verloopt de reactie niet meer goed. nu heb ik dat bij pH 6-14 onderzocht en bij elke pH reageert die niet meer goed wanneer de buffer wordt toegevoegd, terwijl een primaire amine in een alkalisch milieu goed reageert. ik zou niet weten waarom de reactie stopt wanneer ik de buffer toevoeg, want TPM reageert wel. Heeft iemand misschien een idee? het enige wat ik kan bedenken is dat het water van de buffer de reactie verstoord.

p.s. ik heb nog geen gradient elutie gedraaid, maar wel meting met en zonder TPM en I.S.

hieruit kan ik opmaken dat er geen pieken zich onder de TPM en de I.S. pieken bevinden.