Citroenzuur op HPLC

[brockske]

Hoi

Heeft iemand een idee hoe ik citroenzuur en natriumcitraat kan bepalen en scheiden op HPLC? Welk solvent e.d.?

Ik heb het al geprobeerd met flink verdund fosforzuur en flink verdund mierenzuur, zoals beschreven in literatuur, maar er komt niets uit helaas.

Momenteel ben ik gelimiteerd tot een 'standaard' RP-C18 kolom (wel in alle maten), maar ik heb ondertussen ook al eens de vraag neergelegd bij een fabrikant van 100% water kolommen.

Alvast bedankt!

[Epyon]

misschien heb je hier iets aan: http://www.restek.com/advantage/adv_2007_02_05.pdf

hier is ook een artikel waarin ze de bepaling doen: http://www.springerlink.com/content/wm3118...63/fulltext.pdf

text uit de artikel:

Procedure

Standards of 5(-)-malic acid (10 g/l) and citric acid (5 g/l) were prepared

in water and chromatographed as a mixture. Apple juices

were injected directly on to the column without sample preparation.

Injection volume was 50 ltl. Effluent flow-rate was maintained at

1.0 ml/min and detection was achieved by spectrophotometry at

220nm. Mobile phase: 0.01 rn-KH2PO4~).75% H3PO ~ in water.

Standards were prepared monthly and stored at 4 °C.

hopelijk heb je hier iets aan

[brockske]

misschien heb je hier iets aan: http://www.restek.com/advantage/adv_2007_02_05.pdf

hier is ook een artikel waarin ze de bepaling doen: http://www.springerlink.com/content/wm3118...63/fulltext.pdf

text uit de artikel:

Procedure

Standards of 5(-)-malic acid (10 g/l) and citric acid (5 g/l) were prepared

in water and chromatographed as a mixture. Apple juices

were injected directly on to the column without sample preparation.

Injection volume was 50 ltl. Effluent flow-rate was maintained at

1.0 ml/min and detection was achieved by spectrophotometry at

220nm. Mobile phase: 0.01 rn-KH2PO4~).75% H3PO ~ in water.

Standards were prepared monthly and stored at 4 °C.

hopelijk heb je hier iets aan

Thanks. Ik wist al dat Restek beschikt over 100 % water kolommen, maar ik heb op aanraden van iemand even geïnformeerd bij Waters voor een Atlantis T3 kolom.

Ik heb overigens al eens een test gedaan met 6 mM H₃PO₄ (Determination of organic acids in white wines by RP-HPLC, Mira Kordis-Krapez et al) maar hier kreeg ik helemaal niks uit...

Wat ik voor de rest in literatuur terugvind zijn praktisch allemaal 100 % water kolommen.

[brockske]

en om aan te vullen, als ik toch al bezig ben..

Uit "Reverse-phase HPLC on organic acids in musts", M. Llorente et al. haal ik het volgende:

RP-C18, 0,3 ml/min, Eluens 0,02 % formic acid in H₂O

en hier kwam ook niks uit..

[Velders]

Misschien een lullige opmerking maar, zou het aan de detector kunnen liggen?

Verder lijkt het mij dat de stuffen bij een C-18 kolom er nagenoeg meteen uit komen.

[brockske]

Misschien een lullige opmerking maar, zou het aan de detector kunnen liggen?

Verder lijkt het mij dat de stuffen bij een C-18 kolom er nagenoeg meteen uit komen.

Aan de detector liggen, zoals?

Het is een gloednieuwe Diode Array, die zoveel honderd golflengten tegelijk scant en die heeft me nog niet in de steek gelaten bij andere bepalingen.

Ik heb wel al gemerkt dat soms de hele rits er in één keer uit komt, maar ik wil natuurlijk graag mooie piekjes zien

Het is overigens de bedoeling dat ik de componenten van een citroenzuurinfuus kan scheiden (i.e. citroenzuur, natriumcitraat dihydr. en glucose monohydr.).

[Epyon]

waarschijnlijk heeft dit maar weinig effect maar is 0,3 ml/min niet iets aan de lage kant? Want ik weet dat de keren dat ik met HPLC heb gewerkt het altijd rond de 1ml/min was en deze snelheid wordt ook genoemd in beide links die ik gevonden had. In ieder geval zou je dan wel iets sneller een van de componenten moeten detecteren.

en wat zijn ongeveer je concentraties en injectie volume?

[brockske]

waarschijnlijk heeft dit maar weinig effect maar is 0,3 ml/min niet iets aan de lage kant? Want ik weet dat de keren dat ik met HPLC heb gewerkt het altijd rond de 1ml/min was en deze snelheid wordt ook genoemd in beide links die ik gevonden had. In ieder geval zou je dan wel iets sneller een van de componenten moeten detecteren.

en wat zijn ongeveer je concentraties en injectie volume?

ja 0,3 ml/min is erg weinig, maar het stond zo beschreven in het artikel. Concentratie van mijn citroenzuurstandaard is 1 g/l en injectievolume 20 µl.

Ik vind net nog 'n interessant stuk waarbij ze KH₂PO₄/MeOH 95:5 gebruiken als eluens en een standaard van 50 µg/ml (50 mg/l). Dat is dus het uittesten waard.

[Napoleon1981]

Wat scheiden van wat?

Citroenzuur van natriumcitraat? Dat gaat je niet lukken nee. 8-[ Bedenk je eens wat er gebeurd als je natriumcitraat in een zure mobiele fase stopt

Trouwens welke golflengte gebruik je?

[brockske]

Wat scheiden van wat?

Citroenzuur van natriumcitraat? Dat gaat je niet lukken nee. 8-[ Bedenk je eens wat er gebeurd als je natriumcitraat in een zure mobiele fase stopt

Trouwens welke golflengte gebruik je?

True..

Nuja goed, in principe moet ik een citroenzuurpiek zien, dat is het belangrijkst.

Golflengte hoef ik niet in te stellen, met de Diode Array kan ik tussen 190 en 800 nm tegelijk meten, met de software kan ik er de interessantste golflengte uit isoleren en daarmee verder werken.

Daarbij weet ik dat citroenzuur bij 195-200 nm absorbeert, dus tijdens de run stel ik het realtime venster zo in zodat ik tenminste zie of er iets uit komt..

[Napoleon1981]

Ik zou eerder bij 210 gaan meten of 214. Dan zit je verder weg van de solvent background.

Verder moet dit gewoon werken, ik zou nooit 100% water door een kolom gooien, gewoon ff 1% organisch dr bij doen. Als je een goede C18 kolom hebt, dan werkt dit gewoon. Probeer een langzame gradient te draaien als je "niets" ziet, misschien dat het op je kolom blijft hangen.

Als je het echt niet uit het solvent front krijgt, probeer dan een ionpaar reagens (alkyl-quaternairy ammonium ofzo) bij pH 6. Dan heb je zeker een sterke retentie en een significante hoeveelheid organisch nodig om het er af te krijgen

Leon

[mmaarr]

wat is de samenstelling van je eluent?

en wat is de pH van je eluent?

[brockske]

Ik zou eerder bij 210 gaan meten of 214. Dan zit je verder weg van de solvent background.

Verder moet dit gewoon werken, ik zou nooit 100% water door een kolom gooien, gewoon ff 1% organisch dr bij doen. Als je een goede C18 kolom hebt, dan werkt dit gewoon. Probeer een langzame gradient te draaien als je "niets" ziet, misschien dat het op je kolom blijft hangen.

Als je het echt niet uit het solvent front krijgt, probeer dan een ionpaar reagens (alkyl-quaternairy ammonium ofzo) bij pH 6. Dan heb je zeker een sterke retentie en een significante hoeveelheid organisch nodig om het er af te krijgen

Leon

Mja nogmaals, de golflengte is niet zo belangrijk. Moest de piek inderdaad in de solventachtergrond vallen, dan kan ik gewoon een andere interessante golflengte kiezen m.b.v. de software.

Probleem met een standaard ODS (C18) kolom is dat je een collapse krijgt van de C18-staarten als je teveel water erdoor jaagt, dus dat ene procentje methanol/ACN maakt het volgens mij niet.

Ik probeer 'm morgen eerst nog met de laatste methode die ik vond, zijnde 10 mM KH₂PO₄/MeOH 95:5, isocratisch op 0,8 ml/min.

Moest dat weer niks opleveren dan ga ik verder in de richting die jij me hier aanraadt. Even opzoeken hoe dat ook alweer zat allemaal..

wat is de samenstelling van je eluent?

en wat is de pH van je eluent?

Dat varieert dus. Ik heb er eentje op 6 mM H₃PO₄ gedraaid, die had pH 2 komma nog iets, dus de kolom moet er tegen kunnen. Een andere was op 0,02 % HCOOH, dus die pH lag nog wat hoger. Oplossingen werden overigens in water gemaakt (milli-Q).

[brockske]

Oh ja, voor ik het vergeet: ik appreciëer jullie hulp enorm!

[Napoleon1981]

Ik zou eerder bij 210 gaan meten of 214. Dan zit je verder weg van de solvent background.

Verder moet dit gewoon werken, ik zou nooit 100% water door een kolom gooien, gewoon ff 1% organisch dr bij doen. Als je een goede C18 kolom hebt, dan werkt dit gewoon. Probeer een langzame gradient te draaien als je "niets" ziet, misschien dat het op je kolom blijft hangen.

Als je het echt niet uit het solvent front krijgt, probeer dan een ionpaar reagens (alkyl-quaternairy ammonium ofzo) bij pH 6. Dan heb je zeker een sterke retentie en een significante hoeveelheid organisch nodig om het er af te krijgen

Leon

Mja nogmaals, de golflengte is niet zo belangrijk. Moest de piek inderdaad in de solventachtergrond vallen, dan kan ik gewoon een andere interessante golflengte kiezen m.b.v. de software.

Probleem met een standaard ODS (C18) kolom is dat je een collapse krijgt van de C18-staarten als je teveel water erdoor jaagt, dus dat ene procentje methanol/ACN maakt het volgens mij niet.

Ik probeer 'm morgen eerst nog met de laatste methode die ik vond, zijnde 10 mM KH₂PO₄/MeOH 95:5, isocratisch op 0,8 ml/min.

Moest dat weer niks opleveren dan ga ik verder in de richting die jij me hier aanraadt. Even opzoeken hoe dat ook alweer zat allemaal..

wat is de samenstelling van je eluent?

en wat is de pH van je eluent?

Dat varieert dus. Ik heb er eentje op 6 mM H₃PO₄ gedraaid, die had pH 2 komma nog iets, dus de kolom moet er tegen kunnen. Een andere was op 0,02 % HCOOH, dus die pH lag nog wat hoger. Oplossingen werden overigens in water gemaakt (milli-Q).

Mja nogmaals, de golflengte is niet zo belangrijk. Moest de piek inderdaad in de solventachtergrond vallen, dan kan ik gewoon een andere interessante golflengte kiezen m.b.v. de software.

Nogmaals dit is dus wel belangrijk

Je zegt in een andere post dat je NIETS ziet. Dit is dus detector gerelateerd.

Probleem met een standaard ODS (C18) kolom is dat je een collapse krijgt van de C18-staarten als je teveel water erdoor jaagt, dus dat ene procentje methanol/ACN maakt het volgens mij niet.

Volgens jou misschien niet, maar dat 1e procentje maakt dus juist al het verschil in de wereld. Het is 1 procent in de mobiele fase, maar wat denk je dat er gebeurd op een hydrofobe kolom? Juist lokaal is de concentratie veel hoger omdat het zich ophoopt als gevolg maakt dat 1% procentje dus een wereld van verschil. Van niets naar 1% is trouwens ook een mega verhoging relatief gezien.

Nog een tip, het klakkeloos kopieren van andere mensen hun methoden is zinloos, je schiet veel meer op met even helder denken waarom bepaalde dingen zo zijn en variabelen te selecteren die voor jou systeem optimaal zijn. Je draait een kolom altijd bij de juiste flowrate die bij die kolom hoort. Alle methoden die je opnoemt gebruiken trouwens gewoon een zure mobiele fase en welk zuur dat is maakt niet zoveel uit. Kolommen kunnen overig goed tegen zuur, het zijn de basen die ze vernielen.