keuze hoeveelheid organisch zuur in mobiele fase

[jacqy85]

Hallo allemaal,

Ik ben voor mijn stage een methode aan het optimaliseren van paracetamol met caffeine. We gebruiken op dit moment een mobiele fase van MEOH: 1 v/v % azijnzuur met een veroudere kolom (C18 10um 8*100mm).

Voor paracetamol is het aanzuren niet nodig, maar voor caffeine wel. Caffeine is een zwakke base, maar vormt geen stabiele zouten met HCL. Zelf denk ik dat caffeine niet echt een pka waarde heeft (op internet word je gek van de verschillende pka waardes) en in officiele bronnen heb ik er tot nu toe nog niets over gevonden. De oplosbaarheid van caffeine in water wordt vergroot door o.a. organisch zuur (azijnzuur) toe te voegen.

Ik begrijp waarom je in deze situatie de mobiele fase wat aanzuurt, maar ik vraag me af of je zoveel zuur wel nodig hebt?! Heeft meer zuur in deze situatie wel echt effect op je chromatogram? In een andere methode gebruiken ze maar 10 delen (van de 100) 1% mierenzuur voor de bepaling van caffeine. En in de USP staat een mobiele fase van MEOH:H2O:ijsazijn 28:69:3 beschreven. Dit lijkt me toch wel heel erg zuur! Ik vraag me af wat de pH zal zijn.. Ook vind ik diverse pH waardes voor de mobiele fase voor de bepaling van caffeine.

Wat voor hoeveelheid azijnzuur en pH zouden jullie kiezen voor de bepaling van caffeine?

Ow ja, de kolom die ik wil gaan gebruiken is een simple C18 kolom.

Alvast bedankt voor jullie antwoorden!

[Ronnie_CF]

Je wil paracetamol en caffeïne scheiden van elkaar neem ik aan? Daarvoor moet de mobiele fase wel toelaten dat de twee componenten gescheiden zijn uiteraard. Dit is primordiaal. Als je geen scheiden verkrijgt, an je zoveel zitten prutsen aan je mobiele fase als je wilt, dat haalt niets uit.

Je kan voor de hoeveelheid zuur eens opzoeken welke ε^0' je bekomt bij bepaalde toevoegingen (als je vertrouwt zou zijn met de epsiloaarden). Uiteindelijk ga je scheiden op basis van affiniteit natuurlijk.

Dus heeft de hoeveelheid zuur een effect op je chromatogram? Ja sowieso omwille van de polariteit van je eluens.

Is de daling in pH echt nodig om de oplosbaarheid te verhogen trouwens? Bij degelijke technieken zit je toch in het ppm gebied. Lost 1 mg coffeïne niet op in 1 liter water?

[jacqy85]

Paracetamol en caffeine wil ik inderdaad van elkaar gescheiden hebben.

De mobiele fase die nu gebruikt wordt is MEOH: 1 v/v%azijnzuur 25:75. Paracetamol elueert vrij snel van de kolom. Bij de oude kolom op 2,5 min en de piek begint op 2 min (brede piek) en dode tijd is 1,75 min. Resolutie tussen caffeine en paracetamol is 5. Ik vind zelf dat paracetamot er iets te snel af komt.

Bedoel je met epsilon de molaire extinctiecoefficient? Maar dan begrijp ik nog niet de functie van zoveel zuur in de mobiele fase bij deze bepaling (zeker de hoeveelheid die bij de USP methode gebruikt moet worden). HEt zijn toch helemaal geen spannende stofjes? Voor paracetamol is MEOH:H2O 25:75 prima.

Voor deze bepaling wordt het tabletpoeder opgelost in MEOH. Daarna wordt deze oplossing verder verdunt in een oplosmiddel vergelijkbaar met de mobiele fase (is wel iets afwijkend). Je prikt uiteindelijk heel weinig actieve stof op je kolom en de oplosbaarheid van caffeine is 1 gram in 50 ml water. Dus dat mag niet echt het probleem zijn.

[Jooken]

Om stoffen met zure of basische eigenschappen te scheiden met HPLC moet je een zuur of een base toevoegen aan de mobiele fase om de protonering van het molecule te controleren. Een geprotoneerde base zoals caffeïne is veel meer polair dan de niet-geprotoneerde vorm, en zal dus sneller elueren dan de niet-geprotoneerde vorm.

Hierbij is zijn zowel de pH als de buffercapaciteit van de mobiele fase van belang. Zuivere zuren bufferen niet zo heel goed, en dus moet er voldoende van toegevoegd worden om de buffercapaciteit op te trekken.

Een toevoeging van 1% zuur is inderdaad gebruikelijk.

Verder vind ik een resolutie van 5 zeer veel: 2 zou normaal voldoende moeten zijn (als je pieken geen tailing vertonen).

Je gebruikt wel een vreselijk antieke kolom: 10 µm en 8 mm diameter gebruikt tegenwoordig niemand meer. Probeer eens met 5 µm en 3 mm. Je zal vooreerst heel wat solvent besparen. Je huidig debiet vermeld je niet, maar het nieuwe kan je instellen op 0,5 mL/min.

Als je tijd en zin hebt, kan je de invloed van de pH op de retentietijd onderzoeken. Je kan de pH makkelijk variëren door te werken met azijnzuur / natriumacetaatbuffers. Hiermee varieer je de pH tussen 3,5 en 4,5 (en heb je toch voldoende buffercapaciteit). Voor een meer zure of basische pH kan je fosforzuurbuffers gebruiken.

Eventueel kan je met citroenzuurbuffers een zeer breed gebied controleren. Voor je het toestel uitzet wel eerst de buffer uitspoelen met een isocratisch waterig solvent.

Mits goede voorbereiding en een goed toestel kan je een dergelijke optimalisering op een halve dag of zo doen.

[jacqy85]

Bedankt voor de antwoorden.

De kolom is zeer antiek. Het is zelfs een kunstof kolom...Het debiet met deze kolom is 2 ml/min. Het idee is om de methode over te zetten naar een C18 3 um 2,1 x 100mm.

Mijn idee was inderdaad ook om eens met zuur te gaan spelen. Dan krijg ik ook een beter beeld wat pH doet het het chromatogram. Is pH 3,5 - 4,5 gebruikelijk voor zwakke basische componenten?

[Jooken]

Ik kan geen betrouwbare pKa waarde van caffeine vinden, maar aan de structuur te zien moet het een zeer zwakke base zijn (in een compilatie vond ik de waarde van 0,62 ; maar ik kan de originele referentie niet traceren).

Wanneer je de retentietijd van een zwakke base plot als functie van de pH (bij constant % organische modifier), dan bekom je een sigmoïde curve, zoals een titratiecurve, met een kleine retentietijd bij lage pH, en een hoge retentietijd bij hoge pH. Het buigpunt ligt bij ongeveer de pH = pKa. Voor caffeine zou dat betekenen dat de pH zeer laag moet zijn om de retentietijd substantieel te verkorten. Een dergelijk lage pH zal je kolom nooit overleven. Ik zou er gewoon op gokken dat de retentietijd van caffeine onafhankelijk is van de pH, binnen redelijke grenzen.

Paracetamol daarentegen is een fenol, en dus een zwak zuur. Hier is het wel gewenst om de pH van de mobiele fase te controleren, al is het maar om een reproduceerbare retentietijd te krijgen.

Voor de optimalisering van het chromatogram zou ik een standaard aanmaken met paracetamol en caffeine, waarin een duidelijk verschil in piekgrootte is. Hierdoor kan je op het zicht zien wat wat is.

Voor de mobiele fase gebruik je 1% azijnzuur (AcOH) in water en methanol. Neem nu een reeks isocratische chromatogrammen met 100 - 80 - 60 - 40 - ... % MeOH totdat de retentie goed is (de retentiefcator k tussen 2 en 10). Ik verwacht dat beide pieken dan ook gescheiden zullen zijn. Voor een 2,1 mm diameter kolom kan je een debiet instellen van 0,3 mL/min. Kies dan een % MeOH zodat de resolutie 1,5 tot 2 is. Meer is zeker niet nodig. De detectiegolflengte kies je als 254 nm of iets in die buurt.

Voor de finetuning kan je het debiet opdrijven. Dit verkort de retentietijd, terwijl voor een 3 µm kolom de kolomefficiëntie en dus ook de resolutie niet veel zal afnemen (voor 3µm deeltjes verloopt de Van Deemtercurve zeer vlak voorbij het optimum). Verhoog het debiet totdat je aan de maximale druk zit die je systeem aankan, met een veilige marge (naarmate een kolom langer in gebruik is, zal de tegendruk stijgen).

Op die manier krijg je een zeer snelle scheiding, zonder dat dit zeer veel experimenteertijd kost. Ik schat dat het niet meer dan een halve tot een hele dag tijd kost om deze scheiding te optimaliseren.

[jacqy85]

Ik heb zelf ook geen pKa waarde kunnen vinden voor caffeine. In het boek analytical profiles of drug substances staat alleen dat het een een zwakke base is en geen stabiele zouten vormt met sterke zuren zoals HCL.

Voor paracetamol met caffeine wordt in het voorschrift gekozen voor een golflengte van 275nm. Voor alleen paracetamol wordt een golflengte gekozen van 245nm. Bij 275nm zijn beide stoffen goed te detecteren. Voor caffeine is dit de optimale golflengte. Qua piekverhouding is dit ook het beste (de caffeine piek is niet zo heel groot). De concentratie paracetamol is namelijk 10x hoger als die van caffeine. 2 golflengtes is ook geen optie, omdat de concentratie paracetamol dan te hoog is voor het lineaire gebied bij 245nm (en verdunnen heeft ook geen zin omdat de caffeine concentratie weer te laag wordt).

Zou een kolomoven nog een interessante optie zijn? In de USP hebben ze het over een kolomtemperatuur van 45 graden?

Ik ga eerst eens aan de slag met de tips , Bedankt!

[Jooken]

Een kolomoven geeft je in elk geval een meer constante retentietijd. Normaal wordt dat inderdaad aanbevolen.

Laat ook eens horen hoe het resultaat is!

[jacqy85]

Ik heb helaas nog geen echte resultaten om te delen (alleen van de oude kolom). Ik moest afgelopen week een keuring draaien op mijn systeem. Vrijdag wel wat testjes gedaan op de 'oude kolom' maar helaas moest ik mijn systeem weer afstaan voor een nieuwe keuring...

Heeft er iemand ervaring met radial columns van Waters (plastic kolommen van 8x100mm)? Kan iemand mij vertellen wat ongeveer de optimale flow is van zo'n kolom? Ik wilde een van Deemter curve maken, maar dat ging niet helemaal volgens verwachting. Ik heb op flow 1,2,3,4,5 ml/min gedraaid en de schotelhoogte neemt toe naarmate ik de flow verhoog. Het lijkt erop dat ik voorbij mijn optimum heb gemeten, maar ik geloof er niks van dat de optimum flow van die kolommen onder de 1 ml/min ligt. :s

Ik hoop volgende week wat meer te kunnen vertellen.

[jacqy85]

Ik bedenk me ineens dat longitudinale diffusie niet zo'n hele grote rol speelt bij HPLC, maar meer bij GC. Stom stom stom!

Maar kan iemand mij alsnog vertellen met welke flow standaard is voor zo'n plastic kolom? .

[jacqy85]

Eindelijk heb ik wat resultaten om te delen!

Ik heb allereest de methode 1:1 overgezet naar de nieuwe kolom (flow omgerekend, belading en injectie aangepast). De area's komen overeen met elkaar alleen het nadeel is dat de symmetrie van caffeine is verslechtert. Deze was op de oude kolom 1,6 en op de nieuwe kolom 2.

Ik heb de kolomoven op 45 graden ingesteld en ik ben opnieuw gaan meten. De symmetrie van caffeine daalde naar 1,3! Vervolgens ben ik gaan spelen met de mobiele fase. Tot 60:40 (MEOH:1%HAC) valt caffeine onder de paracetamolpiek en komt paracetamol net na de injectiepiek. Bij 40:60 heb ik een resolutie van 1,1, bij 25:75 heb ik een resolutie van 3,7 en een k factor van ca. 0,3 en bij 20:80 heb ik een k factor van 0,4 en een resolutie van 5,8.

Ik heb 1%azijnzuur vervangen door water en dat geeft de volgende resultaten. 25:75 (meoh:h20) k factor 0,3 resolutie 4,1. 20:80 k factor 0,5 resolutie 6,7. Verder geen veranderingen.

Ow ja.....ik heb ook de mobiele fase van de USP getest, 28:69:3 (meoh:h2o: ijsazijn)....pH=2,67. Paracetamol komt echt net na de injectiepiek (k=0.19) en de resolutie is 2,2(paracetamol was moeilijk te integreren door de injectiepiek (eigenlijk dal)).

Ik ben op zich tevreden maar ik ben niet zo blij met de k factor van paracetamol. Gradient is geen optie. De methode moet snel maar wel goed zijn. Vinden jullie 0,3 acceptabel? Zou een kolom met een hogere carbonload nog kunnen helpen voor paracetamol (ik heb nu 10%)?

Alvast bedankt!

[Bjorn1975]

Ik heb een publicatie gevonden waar men gebruik maakt van de USP-settings en een 100mmx3mm 3.5µm kolom gebruikt:

RT paracetamol: 0.78 min

RT caffeine: 1.34min

Tailing factor: <1.2

resolutie: 8.117

Ook hier weer (net als bij je andere post): met een 2.1mmx100mm 3µm zie ik je in de problemen komen met belaadbaarheid en resolutie ...

[jacqy85]

Kun je mij misschien ook vertellen op welk tijdstip de injectiepiek komt bij de publicatie?

Ik heb de USP methode ook getest en de resolutie en de symmetry factor waren prima, alleen had ik een k' van ca. 0,2 voor paracetamol.

Ik zal vanavond een reactie plaatsen over de 2,1 x 100 3um kolom in mijn andere topic.

[Bjorn1975]

Het is moeilijk om te zien op het chromatogram, maar de T₀ = 0,45 min, denk ik, en RT is 0,78. Dit maakt een k' van 0,77

Let ook op de soort phase van de kolom. Een C18 is niet hetzelfde dan een C18 endcapped ...

[jacqy85]

Er kan veel verschil zitten in diverse C18 kolommen. Tegenwoordig zijn de meeste C18 kolommen toch wel encaped

Ik ben zelf niet zo te spreken over de USP methode. Er gaan gewoon 3 delen ijsazijn in de mobiele fase!

Ik heb nu een 4 min run met 25:75 MeOH:1% azijnzuur

Ow ja ik zou nog reageren op mijn andere topic...sorry sorry sorry! @Bjorn1975: Ik heb het antwoord naar je gemaild.