Transcriptie-analyse

[biologiestudent]

Ik zit een beetje verveeld met volgend vraagstuk, maar eerder omdat het mij niet echt lukt om de theorie te doorgronden.. Hopelijk kan iemand helpen:

Stel, je onderzoekt een gen dat vermoedelijk betrokken is bij verhoogde zijwortelontwikkeling, dit enkel wanneer een plant in droogtestress terecht komt. Toon aan:

- in welke delen v/d plant het gen tot expressie zal komen

- in welke cellen dit gen tot expressie zal komen

- dat dit gen enkel tot expressie komt bij droogtestress en niet bij normaal gegroeide planten of bij een tekort aan nutriënten

Wij hebben voor het onderzoek naar de mate van transcriptie 4 methoden gezien:

- Northern-blotting waarbij RNA wordt geladen o/e agarosegel en deze fragmenten worden gescheiden o.b.v. moleculair gewicht; na kleuring met bijvoorbeeld Ethylbromide kan dan worden nagegaan welke genen het sterkst tot expressie komen (je kan niet zien waar de genen tot expressie komen en welke weg ze hebben afgelegd)

- Reportergen fusie waarbij reportergenen worden ingeplant stroomopwaarts van de promoter; deze komen dan tot expressie als de promoter actief is en als er een geschikt substraat aanwezig is; nadeel is dat bij de meeste v deze methoden (vb/ met GUS) de organismen sterven

- In situ hybridisatie waarbij gebruik wordt gemaakt van een probe die hybridiseert met een mRNA met vorming van een heteroduplex die dan in het organisme kan worden gevolgd (zowel op weefsel als op cellulair niveau); dit is een combinatie van microscopie met hybridisatie.

- RT-PCR waarbij cDNA (ontstaan uit een mRNA via reverse transcriptase) op een agarosegel wordt geladen en onderworpen wordt aan een PCR reactie; om weefsels of verschillende condities te vergelijken

voor het oplossen v/d vraag:

a) op weefselniveau: kan met alle 4?

b) op cellulair niveau: ik denk dan enkel met in situ hybridisatie

c) veranderende omstandigheden: via RT-PCR

alvast bedankt

[Wouter_Masselink]

Op weefsel niveau kan je elke genoemde methode gebruiken, dat klopt.

Op cellulair niveau een duidelijke ISH doen (zeker een whole mount) is erg lastig. Je hebt veelal te maken met spikkels die je patroon aangeven en niet duidelijk genoeg zijn om te onderscheiden van je achtergrond op cellulair niveau.

Voor veranderende omstandigheden kan je inderdaad een RT-PCR uitvoeren. Echter als je het gen dat betrokken is al weet en je kan een reporter construct in je organisme knallen (ik ben niet bekend met planten, meer zebravis werk) dan zou je dit kunnen gebruiken om het expressie patroon van weefsels te bepalen, van enkele cellen en ook in variërende omstandigheden. Hierbij ga ik ervan uit dat je een reporter construct gebruikt wat je in vivo in real time waar kan nemen (bijvoorbeeld mCherry).

Nog een kleine opmerking, je reportergen moet onder controle van je promoter naar keuze staan (als je een reportergen upstream van je promoter plaatst, dan zal het expressiepatroon van je reportergen niet overeenkomen met het expressiepatroon van je reporter).

Nog een kleine opmerking, RT-PCR is een robuuste techniek die vroeger veel vaker werd gebruikt dan nu gebruikelijk is. Men schakelt steeds meer over op microarrays en RNAseq. Het is zelfs al in een aantal situaties mogelijk om van 1 enkele cel -na amplificatie- een RNAseq analyse te doen. Met beide technieken kan men genomewide analyses uitvoeren en mogelijkerwijs veel meer relevante data genereren. Echter ben je slechts geïnteresseerd in 1 enkel gen dan is RT-PCR de methode die je voorkeur moet hebben.

Bij in vivo reporter assays dien je rekening te houden met het bereik van je reporter waarin deze lineair is met de mate van expressie. Overexposure kan erg mooie plaatjes geven die toch weinig informatief zijn.

[biologiestudent]

Op cellulair niveau een duidelijke ISH doen (zeker een whole mount) is erg lastig. Je hebt veelal te maken met spikkels die je patroon aangeven en niet duidelijk genoeg zijn om te onderscheiden van je achtergrond op cellulair niveau.

Welk van de methoden kan je dan wel gebruiken om op cellulair niveau een gen te volgen?

Nog een kleine opmerking, je reportergen moet onder controle van je promoter naar keuze staan (als je een reportergen upstream van je promoter plaatst, dan zal het expressiepatroon van je reportergen niet overeenkomen met het expressiepatroon van je reporter).

Inderdaad, ik had mijn cursus verkeerd geïnterpreteerd, de promotor moet stroomopwaarts van het reportergen liggen.

Echter als je het gen dat betrokken is al weet en je kan een reporter construct in je organisme knallen (ik ben niet bekend met planten, meer zebravis werk) dan zou je dit kunnen gebruiken om het expressie patroon van weefsels te bepalen, van enkele cellen en ook in variërende omstandigheden.

Met welk reportergen kan je hier dan werken? Want de meesten doden toch je organisme? Zoals bijvoorbeeld GUS en het luciferinegen... Ben je dan best dat je een GFP (green fluorescent proteïne gen) of verwanten (BFP, RFP, ...) gebruikt, aangezien deze een kleurrijk beeld geven en het organisme niet doden..

Bij in vivo reporter assays dien je rekening te houden met het bereik van je reporter waarin deze lineair is met de mate van expressie. Overexposure kan erg mooie plaatjes geven die toch weinig informatief zijn.

Wat is juist een in vivo reporterassay?

Alvast bedankt voor het antwoord!

[Wouter_Masselink]

Een in-vivo reporter is elke reporter die je in het organisme kan zien zitten terwijl ie nog intact is.

GFP is erg fijn om mee te werken. BFP zou ik niet snel mee werken, deze heeft nogal eens de neiging om cel toxiciteit te vertonen. Alternatief zijn RFP en mCherry (en tegenwoordig vele anderen) ook een mogelijkheid. De rode en groene fluorescente eiwitten geven vaak de beste resultaten en de hoogste quantum yield.

Om op cellulair niveau te bepalen of een gen tot expressie komt kan je een fluorescent reporterconstruct gebruiken. De grootste valkuil hier is dat je zeker moet weten dat je promoter een exacte copy is van de reporter die je gen van interesse ook gebruikt. Weet je dit niet zeker dan is een single cel RNAseq (welliswaar duur en een bruteforce aanpak) een erg gave methode.