Eiwit

[Lyndsey]

Hi allemaal,

Vandaag heb ik een gelfiltratie uitgevoerd om amidase te zuiveren, maar ik heb geen enkel signaal gekregen. Mijn vermoeden is dus dat er helemaal geen eiwit in de oplossing die ik over de kolom heb laten lopen zit. Om dit vermoeden te bevestigen wil ik de oplossing meten in de spectofotometer, maar ik weet niet precies hoe dit in zijn werk gaat. En dan bedoel ik welke golflengte moet ik instellen en hoe zie ik dan of er eiwit in zit? (zie ik dit doordat er gewoon extinctie is?)

Bedankt alvast!

[Raspoetin]

Je LC detector is niets anders dan een spectrofotometer. De gekozen golflengte van die detector zou ik ook gebruiken bij je meting met de spectrofotometer. Echter, deze manier van anlyseren is geen identificatie. Als er extinctie is, kan dit ook door andere componenten veroorzaakt worden. Als je weet welk eiwit je zou moeten hebben, zou je met de molaire absorptie coëfficiënt kunnen goochelen met behulp van de wet van Lambert-Beer:

E = ε * l * c

[Dual]

Eiwit absorbeert sterk bij E280 dus als je een redelijk zuivere oplossing hebt zou je snel iets kunnen meten. Je kunt het ook snel aantonen met bijv. ninhydrine... en bij positief resultaat een scan van de beginoplossing maken.

[Lyndsey]

@Dual:

Dus je bedoelt bij 280 nm meten en dan gewoon kijken of je extinctie hebt? Ik weet niet of de oplossing wel goed zuiver is, want het chromatogram gaf wel allerlei kleine piekjes, maar naar mijn mening geen eiwit dit zou namelijk van het papier af schieten bij een gevoeligheid van 0,02-0,05. Hoe werkt dat dan met het ninhidrine? Kan het ook met CBB? Want ninhidrine is erg schaars bij ons op t lab.

Iemand nog andere suggesties? SHOOT!

[witte_CF]

Als je de extinctiewaarde bij 280nm neemt en die vergelijkt met een controle-buffer oplossing kan je zien of er eiwitten inzitten (of andere stoffen met aromatische verbindingen aangezien deze absorberen bij 280nm). Welk eiwit het dan is, is een andere zaak

Nynhidrine gebruikten wij in combinatie met een papierchromatogram dat dan gedroogd werd en daarna besproeid met de oplossing. Als er kleuring is, is er eiwit.