Brede smeltcurve-piek bij real-time PCR

[kuiken]

Ik doe real-time PCR met SYBR Green. Ik gebruik 2 plasmideverdunningen en één cDNA staal en een blanco. De blanco blijft mooi negatief. Bij bekijken van de smeltcurves vallen de pieken van het cDNA en de plasmides bij dezelfde temperatuur, zoals verwacht, want hetzelfde fragment wordt geamplificeerd, MAAR, mijn cDNA piek is véél breder en niet zo scherp als de plasmide pieken (die mooi samenvallen). Wat is de verklaring hiervoor?

Mvg

[Gideon]

Omdat je geen strakke smeltcurve krijgt denk ik dat in je cDNA amplificatie niet één zuiver product hebt. Je hebt nu dus een soort van smelttraject (dus van verschillende DNA fragmenten). Dit schiet me zo te binnen:

- Wat voor gen amplificeer je, zijn je primers wel specifiek genoeg?

- Wat is de bron van je cDNA en hoe heb je of is dit gemaakt?