identificeren van B en/of T-cellen

[harm p]

Voor een project ga ik B- en T-lymfocyten isoleren en ook identificeren.

Eerst probeer de lymfocyten te isoleren met behulp van Ficoll. Vervolgens wil ik dan graag aantonen dat ik ook werkelijk vl. B- en T-lymfocyten heb.

Eerst doe ik dan een algemene kleuring om te kijken wat er allemaal zo'n beetje in zit (May-Grunwald-Giemsa-kleuring) en vervolgens wil ik speciek B en/of T-lymfocyten aantonen door middel van een kleuringsreactie.

Iemand bekend een soort kleuringsreactie en anders misschien een andere manier om de lymfocyten aan te tonen?

[Gerard]

Lymfocyten typerering gebeurt door flowcytometrie

zie oa de volgende links

http://www.stamcellab.sanquin.nl/Sanquin-n...ExpandSection=4

http://www.cytometrie.nl/protocollen/3-kle...rotocol2001.htm

[harm p]

bedankt voor je reactie!

In de eerste link staat:

"De bodem van de microtiterplaat bestaat uit een membraan die bedekt is met monoklonale antistof tegen een bepaald cytokine, bijvoorbeeld IFNg. Door vervolgens de IFNg aan te kleuren met een tweede, geconjugeerde antistof en bijbehorend substraat, ontwikkelen zich stippen ("spots”) op de plaats waar een antigeen-geactiveerde cel de cytokine heeft uitgescheiden (figuur 1)."

Als ik nu in dit geval T-lymfocyten aan wil tonen zou ik dan toch CD3 kunnen gebruiken, althans een antistof tegen CD3, omdat CD3 vrij specifiek is voor de T-cel? (als ik het wil vergelijken met de B-cel)

Dat zou dan toch de monoklonale antistof zijn? Hoe weet je dan wat de 'geconjugeerde antistof' is/moet zijn?

[Gerard]

Even als voorbeeld anti CD3.

Anti CD-3 is een verkorte vorm voor monoclonaal Host (bv muis) anti humaan CD3

De geconjugeerde antistof is dan iets van mono- of polyclonaal Host (bv geit) anti-muis IgG gelabeld met bv een enzym (bv HRP of een fluorochroom)

edit

[harm p]

Even als voorbeeld anti CD3.

Anti CD-3 is een verkorte vorm voor monoclonaal Host (bv muis) anti humaan CD3

De geconjugeerde antistof  is dan iets van mono- of polyclonaal Host (bv geit) anti-muis IgG gelabeld met bv een enzym (bv HRP of een fluorochroom)

edit

ik geloof dat ik um niet helemaal begrijp.

quote:

"Anti CD-3 is een verkorte vorm voor monoclonaal Host (bv muis) anti humaan

CD3"

Deze reageert op/met het CD3 van de T-cellen, toch!? En om het zichtbaar te worden wordt dan de geconjugeerde antistof dan toegevoegd!? Deze geconjugeerde antistof reageert dan het anti CD-3!? Het enzym is om het zichtbaar te maken op de plot?

sorry hoor... ik probeer het een beter te ontrafelen, maar ik geloof dat ik het principe van Elispot nog niet helemaal door heb...

[Gerard]

Sorry voor de verwarring, jij hebt het wel begrepen maar ik ben de fout ingegaan.

Nogmaals voor CD3

Op een membraam zit bv monoclonaal muis anti humaan CD3 waaraan het CD3 gaat zitten, aan dit gekoppelde CD3 bindt vervolgens een polyclonaal geit anti humaan CD3 waaraan al een enzym is gekoppeld om met een substraat een kleur te krijgen

Bij een geconjugeerde antistof ,hier bv polyclonaal geit anti humaan CD3, is al uitgezocht dat er geen aspecifieke binding optreedt met het monoclonaal muis anti humaan CD3 waardoor je geen vals positieve resultaten krijgt.

[harm p]

Super bedankt..

Zijn hier ook algemene voorschriften voor (zo ja, heb je enig idee hoe ik hier aan zou kunnen komen?)

En 'zo nee', zou ik dan specifiek een databases moeten kijken waar onderzoek is gedaan naar CD3 binding?!

[Gerard]

Ik zou je aanraden om kontakt op te nemen met laboratorium voor haematologie in een academisch of groot regionaal ziekenhuis. Het is een specialistich vakgebied wat een snelle ontwikkeling doormaakt en met een beetje goede wil kunnen die je verder helpen.

Bovendien verwacht ik dat de antisera tamelijk kostbare spullen zijn waarover je niet zomaar de beschikking kunt krijgen. (een setje tussen de 200 en 500 euro)

[harm p]

ok, bedankt!!

Ik zal eens informeren!