[scheikunde] Waarom EDTA toevoegen?

[chochoo]

heb t al opgelost

Hoi,

Ik heb overal gezocht maar kon nergens het antwoord duidelijk vinden, daarom hoop ik dat ik het hier misschien lukt..

Ik heb een mondeling tentamen over DNA isolatie en differentiele extractie om spermacellen te scheiden van vrouwelijke cellen.

Bij de laatste stap van dit protocol, wanneer het mannelijk en vrouwelijk DNA al apart gescheiden is, moet TE-buffer worden toegevoegd en overnacht bij 55°C .

De TE-buffer bestaat uit Tris en EDTA.

Nu is mijn vraag,

Waarvoor dient de EDTA en wat is het verband tussen de EDTA en MgCl₂ die je toevoegt bij de PCR mix?

Ik heb het vermoeden dat dat iets te maken heeft met de enzymen die metaalkernen hebben oid.. help!

Groetjes,

m.

[PlayboybunnieJ]

Ok nu ga ik jou proberen te helpen lol

EDTA vangt metaalionen weg, doordat het complexen met de metalen aangaat. (Welke metalen er precies weggevangen moeten worden, weet ik ook niet precies..) Het werkt het beste bij de pH van het lichaam dus rond de 7.4, je voegt de Tris dus toe om een optimale werking van de EDTA te verkrijgen omdat het de pH constant houd.

Bij onze PCR-mix hebben we: dntp's, primers, DNA, milliq, mgcl2 en taq bijgevoegd. De taq heeft mgcl2 nodig om geactiveerd te kunnen worden of om zijn optimale werking te verkrijgen. Taq is een enzym dat leeft in heetwaterbronnen, in die heetwaterbronnen zit ook mgcl2..

Ik hoop je een beetje te hebben geholpen en succes dinsdag bij je mondeling!

[chochoo]

dat was wat ik zocht ja, thx

[aSY a]

Wij hebben ook DNA geisoleerd. En we hebben gewoon een kant en klare protocol gekregen maar ik snap niet precies waarom elk stap nou uitgevoerd wordt.

We hebben als eerst fysiologisch zout toegvoegd en afgedraaid. Dit hebben we drie keer herhaald. Volgens mij is dit om onzuiverheden weg te spoelen?

Daarna hebben we een enzymmix toegevoegd dat uit EDTA, lyzosym en lyzostaphin bestaat. Lyzosym zorgt ervoor dat de peptidoglycaan bindingen hydroliseren, waardoor het celmembraan poreus wordt en osmose scheuren ontstaan? Waar zorgt lyzostaphin eigenlijk voor?

Daarna hebben we 10% SDS en proteinase K toegevoegd. Sodium dodecyl sulfate, dat heeft ook een reinigende functie dacht ik? Het denatureert eiwitten? En proteinase K zorgt ervoor dat eiwitten afgebroken worden?

Vervolgens hebben we phenol/chloroform/isoamyl alcohol toegevoegd. Waarom werd dit eigenlijk gebruikt?

Natriumacetaat werd toegevoegd. Ehmm, zorgt dat voor de pH?

Vervolgens is ijskoude ethanol (96%) toegevoegd. Maar waarom?

Daarna is TE buffer en RNAse toegevoegd. TE buffer zorgt voor een optimale pH en voor de zoutconcentratie? RNAse is om RNA af te breken?

Kan iemand mij vertellen of ik een beetje in de goede richting zit? Alvast bedankt!

[Chemist]

Ik zal je proberen te helpen.

[...]

Daarna hebben we een enzymmix toegevoegd dat uit EDTA, lyzosym en lyzostaphin bestaat. Lyzosym zorgt ervoor dat de peptidoglycaan bindingen hydroliseren, waardoor het celmembraan poreus wordt en osmose scheuren ontstaan? Waar zorgt lyzostaphin eigenlijk voor?

[...]

Ik neem aan dat je het DNA geïsoleerd hebt uit bacteriën?

Lysozym (let ook op de spelling) beschadigt bacteriële celwanden door de peptidoglycaanlaag (die m.n. wordt aangetroffen in Gram-positieve bacteriën) in de celwand af te breken. Volgens mij wordt lysostafine ook gebruikt voor het openbreken van de celwanden; zover ik weet zijn Staphylococci hier gevoelig voor (?).

[...]

Daarna hebben we 10% SDS en proteinase K toegevoegd. Sodium dodecyl sulfate, dat heeft ook een reinigende functie dacht ik? Het denatureert eiwitten? En proteinase K zorgt ervoor dat eiwitten afgebroken worden?

[...]

SDS is een zeep/detergent, iets wat hydrofobische moleculen (vetten) oplost. Het emulgeert de celmembranen, waardoor de inhoud van de cellen (DNA, eiwitten, RNA, enz.) vrijkomt.

[Voor SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) wordt SDS inderdaad ook gebruikt om alle eiwitten in het sample te denatureren tot eenzelfde lineaire vorm, maar ook om een negatieve lading aan te brengen.]

Proteïnase K breekt inderdaad je eiwitten af. De functie van SDS voor het oplossen van je membranen is voor je DNA-isolatie dus volgens mij veel belangrijker dan zijn denaturerende functie, dit aangezien je eiwitten toch worden afgebroken.

[...]

Vervolgens hebben we phenol/chloroform/isoamyl alcohol toegevoegd. Waarom werd dit eigenlijk gebruikt?

[...]

Door het toevoegen van chloroform/isoamylalcohol wordt een fasenscheiding bewerkstelligt. In de bovenste fase (waterfase) bevindt zich dan het DNA in opgeloste vorm.

[...]

Natriumacetaat werd toegevoegd. Ehmm, zorgt dat voor de pH?

[...]

Nee. Natriumacetaat (NaAc) is een zout welke nodig is voor het laten precipiteren (neerslaan) van het DNA. De cationen (positieve ionen) die ontstaan na toevoegen van het zout neutraliseren de negatieve ladingen van de fosfaatgroepen in het DNA. Hierdoor wordt het DNA veel minder hydrofiel, en daarom veel minder oplosbaar in water.

[...]

Vervolgens is ijskoude ethanol (96%) toegevoegd. Maar waarom?

[...]

Water heeft een hoge dielektrische constante. De dielektrische constante van ethanol is daarentegen veel lager en hierdoor kan het Na⁺ (van het NaAc) veel gemakkelijker interacteren met de fosfaten in het DNA. Ethanol bevordert dus de DNA-precipitatie.

EtOH wordt ook wel vaker gebruikt om de zouten weer uit je samples te "wassen".

[...]

Daarna is TE buffer en RNAse toegevoegd. TE buffer zorgt voor een optimale pH en voor de zoutconcentratie? RNAse is om RNA af te breken?

TE-buffer is een buffer die, zoals hierboven al is gezegd, bestaat uit Tris en EDTA [welke cationen (zoals Mg²⁺) wegvangt]. TE-buffer wordt gebruikt om het DNA te beschermen tegen degradatie (afbraak).

En zoals je zelf zegt: RNAse breekt RNA af. Je bent bij DNA-isolatie louter geïnteresseerd in je DNA, en je wil geen contaminatie van je DNA door RNA.

Heb nu ook even geen boeken ter mijn beschikking om een en ander te controleren, maar ik ga er vanuit dat mijn uitleg klopt. Zo niet, dan wordt ik graag door een ander gecorrigeerd.