[scheikunde] Enzymactiviteit

[Xmar]

Hallo allemaal,

Nou ben ik op school bezig met een praktijk waarin we eerst de enzymactiviteit hebben gemeten met een spectrofotometer. dit hebben wij gemeten bij 0, 20, 40 en 60 seconden.

Daar kwamen volgens de leraar onbruikbare waardes uit omdat de delta tussen 0 en 60 te groot was.

Wij hebben onze celvrije extracten nog een keer afgedraaid op de micrcentrifuge, maar daarna hadden wij helemaal geen waardes meer.

Toen hebben we de eiwitbepaling volgens Bradford gedaan, en daar kwamen we wel positieve waardes tegen.

We hebben dus geen enzymactiviteit maar wel Eiwitten,

Nu zijn we bij de discussie aan beland en we kunnen niet echt bedenken waar dit door komt,

Iemand ideeën?

[biochemiefreak]

Zou je de reactie beter kunnen beschrijven?

Je hebt enzymen en subtraat en je moet het verschil met een spectrofotometer aan tonen, maar door welke reactie krijg je een spectrofotometrisch verschil? Vanuit welk extract wil je je enzym aantonen? Eiwit aanwezigheid in een extract is best logisch je hebt te maken met opgeloste eiwitten. Het zou ook nog kunnen dat je enzymen al op gereageerd zijn of dat er geen substraat meer aanwezig is of deactiveerd door externe omstandigheden(temperatuur, pH, enz)

MvG Ron

[Xmar]

Hey bedankt voor de reactie.

We hebben bakkergist opgelost met aluminiumoxide. Dit mengesel hebben we gemortierd (om te kijken wat de optimale homogenisatie duur is)

En dit is gecentrifugeerd.

en het supernatant hebben we gedecanteerd. En dat supernatant hebben we gebruikt voor de enzymactiviteit.

We hebben een reactiecocktail gemaakt met pyrofosfaat NAD+ en Ethanol absoluut

En daar hebben we dat supernatant bij gedaan en dan om de 20 seconde de extinctieverandering gemeten.

En daar ging het dus mis, dat we geen activiteit meer konden meten.

[biochemiefreak]

Zou je de verwachte reactie ook op kunnen schrijven en om welk enzym het gaat? Heb je rekening gehouden met producten die een negatief effect kunnen hebben op dit enzym dat je hem deactiveerd of dat je het enzym door temperatuur verhoging moet activeren?

[Xmar]

Volgens mij gaat het om het Enzym ADH.

en de reactie zou dan,

Ethanol + NADplus ---> Ethanal + NADHA + Hplus

We hebben gewoon de themawijzer gevolgd en de rest van de klas had geen problemen dus ik denk niet dat er een product is geweest wat een negatief effect heeft gehad.

Kan het te maken hebben met het feit dat wij het 2 keer gecentrifiguurd hebben?

Dat is een van de enige dingen die wij anders hebben gedaan dan de rest van de klas.

We hebben het trouwens steeds op ijs bewaard, mischien dat het temperatuur verschil dan te groot was?

[Vink13]

Als er nog steeds eiwitten in de oplossing zitten is het enzym waarschijnlijk nog wel aanwezig maar is het niet meer actief. Alle enzymen verliezen na verloop van tijd hun activiteit, de één wat eerder dan de ander. Hebben jullie het enzym veel langer bewaard dan de rest van de klas? Hebben jullie het enzym echt constant op ijs bewaard, want dat is namelijk wel belangrijk. Daarnaast beschadigd het centrifugeren de enzymen en was de tweede keer centrifugeren fataal voor de activiteit.

Eigenlijk is hier maar één oplossing voor en dat is opnieuw beginnen met het experiment, aangezien je gedenatureerde enzymen niet meer tot "leven" kunt wekken.

[Xmar]

We hebben het niet langer bewaard dan de rest van de klas, want we hadden een redelijk strak tijdschema. Op ijs hebben we het wel constant bewaard, dus dat moet wel goed zitten.

We gaan nu gewoon de discussie van ons verslag schrijven, we hebben nu genoeg ideeën hoe het gebeurt kan zijn.

Heel erg bedankt voor de reacties.