Northern blotting

[popsy]

Beste,

In de les werd gevraagd hoe je kan achterhalen welke cel een bepaald proteïne

aanmaakt, het antwoord was dat dit kan adhv Northern blotting.

Ik versta wel dat je dan eerst je mRNA van alle cellen moet opzuiveren adhv een oligo dT staart, maar dan moet je deze in een polyacrylamide gel brengen om ze te scheiden op grootte. Maar hoe deel je dit in? Is 1 vakje op je gel 1 cel of maar enkele mRNA's? Kost dit proces dan niet enorm veel tijd?

Groetjes,

Popsy

[Kravitz]

Maar hoe deel je dit in? Is 1 vakje op je gel 1 cel of maar enkele mRNA's? Kost dit proces dan niet enorm veel tijd?

Bedoel je hier je in één laantje op je gel het RNA breng van een eerste celtype en in laantje 2 het RNA van een tweede celtype?

Op zich gaat dit proces lukken, maar ik denk dat het gemakkelijker kan.

Ten eerste is mRNA niet zo bijzonder stabiel en ten tweede is een hoeveelheid mRNA niet rechtstreeks gecorreleerd met de hoeveelheid eiwit in een cel.

Persoonlijk zou ik gaan voor een Western blot. Hierbij zuiver je de eiwitten uit beide celtypes op en loop je een SDS-page. Vervolgens hybridiseer je met een specifieke probe voor je eiwit van interesse.

[popsy]

Bedankt voor het snelle antwoord!

Ja dat was hetgene waar ik over twijfelde..

Dus je ziet het ook zo dat je per laantje het mRNA van een ander celtype zou brengen?

Aja, dan is die western blot misschien beter, maar die techniek hebben we niet uitgebreid gezien in de

les.. Gewoon dat dat een zuivering is van eiwitten adhv antilichamen..

Alvast bedankt!

Dus over die Western blot, wat bedoel je dan met het zuiveren van eiwitten uit BEIDE celtypes?

En dat zuiveren kan dan via centrifugatie ofzo?

[Sjitty]

Gewoon dat dat een zuivering is van eiwitten adhv antilichamen..

De Western blot op zich is geen preparatieve zuiveringstechniek, maar een analytische detectietehniek. De antilichamen worden hierbij dus NIET gebruikt om het eiwit op te zuiveren maar om ze te detecteren op de gel. Wel dien je uiteraard op voorhand het eiwit op te zuiveren (maar niet per se in grote hoveelheden).

Dus over die Western blot, wat bedoel je dan met het zuiveren van eiwitten uit BEIDE celtypes?

Je gaat culturen van beide celtypes apart lyseren, en het lysaat (eventueel na extra opzuiveringen) in 2 verschillende laantjes op je gel laden. Na het blotten (= overbrengen op een speciaal membraan en stainen met antilicchamen tegen jouw eiwit en visualiseren) vergelijk je beide laantjes en zal je zien waar je wel of niet een bandje ziet (of eventueel een bandje bij beide, maar een verschil in intensiteit of geen verschil etc..)

En dat zuiveren kan dan via centrifugatie ofzo?

Algemeen ga je eerst de cellen lyseren (chemisch of mechanish), alle debris (grote stukken van cel) verwijderen via centrifugatie, en de overblijvende "heldere" oplossing die nu nog alle oplosbare componenten bevat (eiwit, DNA, RNA en andere biomoleculen) verder behandle om de molecule naar keuze uit te halen. Dit kan op verschillende manieren en hangt af van het eiwit zelf, de informatie waarover je al dan niet reeds beschikt en of je eventueel jouw eiwit van interesse zelf hebt gelabeled met tags specifiek voor opzuivering. Indien je geen gebruik maakt van zon tags, gebeurt opzuiverign van eiwitten vaak via precipitatie (neerslaan) ervan door toevoeging van zouten (vb ammonium sulfaat) of andere moleculen die eiwitten doen neerslaan. Op die manier kan je al een groot deel van de eiwitten scheidenvan de rest van je mengsel. Contaminerend DNA en RNA kan je eventueel verwijderen via nuclease enzymen. Alhoewel het eigenlijk ook mogelijk is om meteen het volledige lysaat (zonder verdere opzuivering van de eiwitten) op gel te laden, is de kans groter om "mooiere" gels te bekomen indien je toch een beetje het mengsel opkuist.

Ten eerste is mRNA niet zo bijzonder stabiel en ten tweede is een hoeveelheid mRNA niet rechtstreeks gecorreleerd met de hoeveelheid eiwit in een cel.

Dit is toch wel een héél terechte en belangrijke opmerking, en als ik jou was zou ik dat toch even aanhalen in de volgende les. Zeker gezien de vraag letterlijk is "welke cel een bepaald proteïne aanmaakt", geeft mRNA analyse via northern botting geen uitsluitsel.

[Benm]

Alhoewel het eigenlijk ook mogelijk is om meteen het volledige lysaat (zonder verdere opzuivering van de eiwitten) op gel te laden, is de kans groter om "mooiere" gels te bekomen indien je toch een beetje het mengsel opkuist

Het hangt natuurlijk ook van de abudantie van het eiwit dat je onderzoekt af: als je bijvoorbeeld cellen hebt getransfecteert die het in grote hoeveelheden maken, dan hoef je niet per se andere eiwitten te verwijderen om duidelijke resultaten op gel te krijgen.

Preparatief western blotten kan in principe wel, maar gezien je de eiwitten denatureert voor het blotten zullen ze in ieder geval niet meer functioneel zijn als je ze uit de gel snijdt. In principe zou je echter wel de aminozuurvolgorde nog kunnen analyseren, bijvoorbeeld om een mutatie te vinden in een eiwit.