Primer ontwerp voor qPCR

[Coolyo_Lars]

Beste lezer,

Momenteel ben ik bezig met onderzoek naar clostridium chromiireducense. Hiervoor moet ik een qPCR opzetten om aan te tonen in welke hoeveelheden deze bacterie aanwezig is in een monster. Echter loop ik tegen een probleem aan naar deze bacterie is eigenlijk nog nauwelijks onderzocht, hierdoor zijn er nog geen primers bekend enkunnen geen primers uit de literatuur gebruikt worden. De logische volgende stap is om met PrimerBLAST primers te ontwikkelen. Echter komen hier geen soortspecifieke primers uit. Ons was toen door een leraar de tip gegeven om met arb-silva en clustal omega met Mview zelf primers te ontwerpen. Hier zijn wij nu enkele dagen mee aan het klooien maar we kunnen geen gebied in de sequentie van het 16S-rrna gen vinden om primers op te laten binden. En nog een bijkomend ander probleem is dat het PCR product ongeveer een lengte van 500 bp moet hebben.
Nu is mijn vraag of iemand nog een andere manier weet om de primers te zoeken of een tip heeft.

[Wouter_Masselink]

Het is natuurlijk niet nodig om een PCR specifiek voor 16S te doen, als je alleen maar de hoeveelheid van Clostridium chromiireducens dient aan te tonen. Het genoom voor C chromiireducens is 1.324 Kb lang https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/14 ... port=fasta .

Als je een stuk hiervan blast naar andere Clostridicum soorten dan zie je dat de conservatie niet zo heel hoog is.

Als ik nu een stuk van het genoom in primer3plus gooi dan krijg ik bijvoorbeeld dit als resultaat.

Primer 1 ACGACTTAACCCCCGACTCT
Primer 2 AAGCTTTTCACCACCACCAC

ACGACTTAACCCCCGACTCTCATCTGGAGGGTTATAATAAAACTGTTTATTATAAAGATTTCGAGGATACAAGGCTTATAATTCTTAATGCCTTCCACTTTGGTTCAACTCATAAAATTAGTGAAGACCAACTTAGTTGGTTTAAAGAAGCAGCTTCTAAATGCATAAAGAATAAGCTTGTTTTTATTCATTCCCCGGCCTTTCCTACTGGTGCCCATCTTGGCCATTGTCTAGATTTATATCCAGAATATAGGGATGCTTTTTGGAGAATAGTTGATGAATGTGGTATAGATATAGTCTTCTCAGGCCACGAGCATAACTACTCAAGAAGAATAGTTGATAATTCCTTTGGTAATGTAGATAACTGCTATAAAAGAAAAGTTACTCAAGTAATTACTGGTGGTGGTGGTGAAAAGCTT

Als we dit stuk nu weer blasten dan zie je dat er maar 1 soort gedeeltelijk aligned en de primers niet zouden moeten binden.

[Coolyo_Lars]

Dag Wouter,
Maar als ik deze primers in primerblast gooi en ik zeg zoek op alle bacteriesoorten dan krijg ik dat de primers helemaal nergens op hechten

[Wouter_Masselink]

Welke selectie heb je gedaan in primer blast? Deze primers binden in het genoom en niet perse in het cDNA. specifieke primers ontwerpen die niet in een exon vallen is vele malen makkelijker. Ik kan er weinig aan doen dat primerblast irritante software is om mee te werken.

Je kan bijvoorbeeld ook handmatig een inspectie doen (ik gebruik snapgene) en zien dat deze primers gewoon netjes binnen het genoom binden.