Genetica: hoe gen in vector brengen?

[Buck]

Er wordt voortduren gesproken over gentherapie e.d. , maar nergens wordt er deftig uitgelegd hoe ze het gen nu precies in een virus/andere vector brengen...

Wordt er gebruik gemaakt van promoters ofzo?

Graag wat correcte uitleg.

Bedankt

[jefcox]

inderdaad

En hoe vervoert en levert de vecter het gen af?

jef

[Wouter_Masselink]

inderdaad

En hoe vervoert en levert de vecter het gen af?

jef

De vector levert het gen af op verschillende manieren. Vaak kunnen plasmiden via electroporatie of een andere techniek worden ingebracht. Wanneer een virus vector wordt gebruikt dan zal dit virus zich net zoals in de natuur de gastheer cel infecteren. Wanneer je te maken het met een retro-virus (zoals gebruikelijk bij gen-therapie) dan zal deze vector zich in het chromosomaal DNA van de gastheercel plaatsen.

Een promotor zal altijd worden gebruikt. Anders zal je insert niet worden afgelezen. Ik vindt je vraag verder vrij onduidelijk. Kan je een iets gerichtere vraag stellen?

[Buck]

OK dus je hebt een schaaltje met virussen, adenovirussen bijvb. en je hebt een gen dat je hebt kunnen afzonderen. Dan meng je gewoon beiden met een promoter bijvb. deze van Herpes Simplex en het is gebeurt? Het gen gaan zich dan automatisch in het genoom van het virus aansluiten?

[Wouter_Masselink]

OK dus je hebt een schaaltje met virussen, adenovirussen bijvb. en je hebt een gen dat je hebt kunnen afzonderen. Dan meng je gewoon beiden met een promoter bijvb. deze van Herpes Simplex en het is gebeurt? Het gen gaan zich dan automatisch in het genoom van het virus aansluiten?

Nee, zo makkelijk is het niet. Uitgaande van een plasmide (idee is hetzelfde als een virus, alleen zonder eiwit envelop), dan bevat deze al een promotor. Er is dus een startsite (atc) bekend. Deze kan worden gedigesteerd met bijvoorbeeld NcoI. Hierna moet nog een andere digestie worden uitgevoerd van de plasmide. Let er hierbij op dat je een restrictie enzym kiest welke in dezelfde buffer werkt als je eerste restrictie enzym (NcoI), maar 1 keer in je plasmide knipt en het liefst stiky-ended.

Vervolgens voer je een PCR uit van je targetgen. Dit doe je met primers die je zo hebt ontworpen dat je restrictiesites toevoegd aan je plasmide welke overeenkomen met de restrictiesites welke al in je plasmide zijn gedigesteerd. Deze digesteer je ook.

Nadat alles is gezuiverd dan kan je het target gen en je plasmide bij elkaar brengen en aan elkaar ligeren met behulp van ligase.

Het is niet verstandig om een aparte promotor aan je plasmide toe te voegen. Dit maakt het allemaal veel gecompliceerder.