OK dus je hebt een schaaltje met virussen, adenovirussen bijvb. en je hebt een gen dat je hebt kunnen afzonderen. Dan meng je gewoon beiden met een promoter bijvb. deze van Herpes Simplex en het is gebeurt? Het gen gaan zich dan automatisch in het genoom van het virus aansluiten?
Nee, zo makkelijk is het niet. Uitgaande van een plasmide (idee is hetzelfde als een virus, alleen zonder eiwit envelop), dan bevat deze al een promotor. Er is dus een startsite (atc) bekend. Deze kan worden gedigesteerd met bijvoorbeeld NcoI. Hierna moet nog een andere digestie worden uitgevoerd van de plasmide. Let er hierbij op dat je een restrictie enzym kiest welke in dezelfde buffer werkt als je eerste restrictie enzym (NcoI), maar 1 keer in je plasmide knipt en het liefst stiky-ended.
Vervolgens voer je een PCR uit van je targetgen. Dit doe je met primers die je zo hebt ontworpen dat je restrictiesites toevoegd aan je plasmide welke overeenkomen met de restrictiesites welke al in je plasmide zijn gedigesteerd. Deze digesteer je ook.
Nadat alles is gezuiverd dan kan je het target gen en je plasmide bij elkaar brengen en aan elkaar ligeren met behulp van ligase.
Het is niet verstandig om een aparte promotor aan je plasmide toe te voegen. Dit maakt het allemaal veel gecompliceerder.
[quote]OK dus je hebt een schaaltje met virussen, adenovirussen bijvb. en je hebt een gen dat je hebt kunnen afzonderen. Dan meng je gewoon beiden met een promoter bijvb. deze van Herpes Simplex en het is gebeurt? Het gen gaan zich dan automatisch in het genoom van het virus aansluiten?[/quote]
Nee, zo makkelijk is het niet. Uitgaande van een plasmide (idee is hetzelfde als een virus, alleen zonder eiwit envelop), dan bevat deze al een promotor. Er is dus een startsite (atc) bekend. Deze kan worden gedigesteerd met bijvoorbeeld NcoI. Hierna moet nog een andere digestie worden uitgevoerd van de plasmide. Let er hierbij op dat je een restrictie enzym kiest welke in dezelfde buffer werkt als je eerste restrictie enzym (NcoI), maar 1 keer in je plasmide knipt en het liefst stiky-ended.
Vervolgens voer je een PCR uit van je targetgen. Dit doe je met primers die je zo hebt ontworpen dat je restrictiesites toevoegd aan je plasmide welke overeenkomen met de restrictiesites welke al in je plasmide zijn gedigesteerd. Deze digesteer je ook.
Nadat alles is gezuiverd dan kan je het target gen en je plasmide bij elkaar brengen en aan elkaar ligeren met behulp van ligase.
Het is niet verstandig om een aparte promotor aan je plasmide toe te voegen. Dit maakt het allemaal veel gecompliceerder.
