De cycletijd voor peptides is natuurlijk groter dan voor jouw small molecules en we gebruiken het volledige bereik van die traps (200-2000). In MS/MS condities heb je natuurlijk te maken met de 1/3 cut off regel bij het gebruik van een iontrap dus daar buiten kijken heeft geen zin.

Maargoed wanneer je in de literatuur kijkt is de ion-trap het meest gebruikte instrument in proteomics LC-MS. Overigens draaien de meeste ion-traps wel in dynamic exclusion, dus men neemt 3x een MS/MS op van de 3 meest voorkomende ionen met een bepaalde massa, waarna dat ion op een exclusion list terecht komt en vervolgens een aantal minuten niet meer aan MS/MS onderworpen wordt. Zo'n serie van 3 MS/MS nemen en 1 MS scan duurt een paar seconden, dus als je piek zo'n 10 seconden breed is, dan heb je het maximale aantal MS/MS scans wat mogelijk is (ik negeer dubbel geladen ionen etc). Maargoed in principe is 1 MS/MS scan genoeg voor een identificatie dus een piekbreedte van een seconde of 3 of misschien wel minder zal je al vertellen wat je weten wilt. Het voordeel van smalle pieken is lage detectie limieten en heeft tot gevolg dat alle massa in 1 cycle van je MS terecht komt wat de S/N ratio enorm verbeterd.

Die laatste opmerking is interessant.......wat zijn dan de omstandigheden van je trap? Massabereik, excitatietijd, traptijd etc.? Ik vraag me af of die instellingen voor peptides (waar ik geen ervaring mee heb op traps) dan wezenlijk anders zijn dan voor mijn ''small molecules'' tot MM 500., en dit dan grote effecten heeft op de totale cycle time. Overigens heeft dit met de topic ook weer niks te maken, maar van het een komt het ander

Wij hebben hier 2 iontraps draaien op nano LC, gaat prima. Ik gebruik zelfs een FTICR met een 3D iontrap upfront en UPLC. Ik heb over die opmerking van je ook zelf een tijdje na zitten denken en ik heb zelfs een keer in praatje over gehad, waar mijn opmerking niet erg veel bijval kreeg to say the least . Ik zei toen het zelfde als jij, dat naalden de cycletijd van een iontrap overschrijden.

Helemaal mee eens, maar je zult het dus ook met me eens zijn dat de combinatie chromatografie/type MS de waarde van de meting bepaalt. Overigens is dat infusie verhaal ook iets waarover ik het met je eens ben: we werken eraan, het is een punt van aandacht, maar is iets voor volgend jaar (budgetten etc.).

- Als Beaker een quadrupool MS heeft, al dan niet met MSMS mogelijkheden, en het gaat om een kwantitatieve meting, dan kan hij zowel ''standaard'' als capillaire of nanoLC of UPLC gebruiken. De cycle time van de MS is dan in ieder geval hoog genoeg om voldoende meetpunten over de chromatografische piek te hebben. In dit geval moet hij de chromatografie goed optimaliseren en met ''standaard'' LC zal hem dat meer moeite kosten dan met capillaire of nanoLC, dit om ion supressie door matrix effecten te voorkomen. APCI kan dit matrix effect verkleinen, afhankelijk van de thermische stabiliteit van zijn analieten, maar zal coelutie niet uitschakelen. Aandacht besteden aan de chromatografie blijft een belangrijk punt.

- Als Beaker een 3D ion trap heeft, dan zou ik nanoLC of UPLC niet eens proberen: het heeft geen zin. . Ik heb het laatst zelf geprobeerd, via een Triversa Nanomate gekoppeld met UPLC, en het was geen succes. De Ion Trap is gewoon niet snel genoeg om de LC pieken te volgen, tenminste niet in full MS mode. Als Beaker toevallig een Linear Ion Trap heeft, dan kan ik er niet veel over zeggen omdat ik daar geen ervaring mee heb (we hebben er overigens wel eentje), maar het lijkt me dat er hetzelfde voor geldt als voor de 3D Trap. Kwalitief is hoge resolutie LC voor Ion Traps zinloos, voor kwantitatief gebruik weet ik het niet.

- Als Beaker de beschikking heeft over een QTOF of ander TOF apparaat, dan is nanoLC of UPLC zeker de moeite van het overwegen waard. Maar nog steeds is het maar de vraag of hoge resolutie chromatografie voor zijn toepassing nodig is.

We wachten op de inbreng van Beaker. Beaker waar ben je?

Ja maar het ging hier over matrix effects en niet over structuur opheldering. Dit zijn 2 totaal verschillende onderwerpen natuurlijk. In het geval van matrix effects draait alles om de separation power.

Om daar dan maar even op structuur opheldering in te gaan. Ik ben het helemaal met je eens. Een infusie is dan trouwens nog veel beter dan een LC-MS run, dan kun je wat gaan spelen met collision energie en noem allemaal maar op, om de data te generen die je wat over de structuur vertelt.

Nog even voor de grap, Napoleon1981, jij hebt het telkens maar over naalden van pieken, maar naalden van pieken is iets waar je als massaspectrometrist vaak helemaal niet zo blij mee bent. Voor het doen van MS en MSMS en MSn experimenten heb je tijd nodig, en dus is een optimale chromatografie met zo smal mogelijke pieken helemaal niet zo voordelig als je - zoals ik - structuuropheldering van metabolieten moet doen........ Dit even ter overdenking en voor de grap en voor een deskundig commentaar natuurlijk

Sorry overigens voor mijn wat ongenuanceerde bericht over ''geloofsverkondiging'' en ''Jehovah's getuigen''. Als ik je reactei erop lees, was dit niet nodig geweest. Mijn excuses.

Uitstekend, Napoleon1981, we zijn het min of meer eens! Het kwam me even voor dat dit tot een van de meest grote onwaarschijnlijkheden ter wereld ging behoren. Overigens realiseer ik me nu dat ik een misschien wat ongelukkige terminologie heb gebruikt. Wat ik bedoelde met piekverbreding, was piekverbreding van ''standaard'' LC kolommen ten opzichte van microbore of nanobore kolommen ....... ik had dat duidelijker moeten maken. De theoretische aspecten van gradientelute zijn me wel duidelijk, laat daar geen misverstanden over bestaan. Ik ben, net als jij, Napoleon1981, overtuigd van de voordelen van miniaturisering van kolomdimensies, maar ik vraag me echt af of Beaker dit wel nodig heeft voor zijn applicatie. Het is meer een practische overweging:

- Beaker weet welke verbindingen hij wil meten. Scheiding van zijn ''target compounds'' is genoeg. Hij is niet geinteresseerd in onbekenden, en kan zijn chromatografie optimaliseren op standaarden. Met een standaard LC kolom met een diameter van 1-2 mm en een lengte van 10-15 cm, 3-5 um particle diameter en C18 zal hij voldoende scheiding kunnen bewerkstelligen.

- Door een kolom met ''standaard'' dimensies te gebruiken, zal hij niet tegen extra column effecten aanlopen, welk risico wel bestaat als een je nano LC kolom gebruikt met een splitter, zoals Napoleon1981 voorstelt. De scheiding van nanoLC kolomen kan dan wel heel goed zijn, als je niet ingevoerd bent in de oorzaken van piekverbreding voor en na de kolom, dan kan nanoLC nog wel eens heel teleurstellend zijn.

- Beaker heeft geen zeldzame, met een hoop moeite verkregen samples. Hij heeft voldoende sample en kan ook makkelijk met zijn sample de chromatografie optimaliseren. Als het sample op is, zal de groenteboer op de hoek graag nog een kilo tomaten aan hem verkopen. Het is niet zoals in de proteomics, waar je het vaak met een of twee injecties moet doen.

- APCI is een goede methode voor dit soort verbindingen. Met APCI zal je ionsupressie kunnen elimineren ....... maar niet co-elutie van matrixcomponenten. Het effect van coelutie kun je testen door standaarden te spiken aan de matrix en te kijken of de linearitet, accuracy en precision van je ijklijn nog voldoet aan je vooraf gestelde crteria. Is dit niet zo in MS mode, dan kun je nog gaan naar MSMS mode, en nog selectiviteit winnen......als Beaker tenminste een Triple Quad heeft, dat weten we niet. Dit geldt voor het geval het een kwantitatievce analyse betreft.

- Voor kwalitatieve analyse -structuuropheldering- ben je sowieso gebonden aan MSMS om structuuropheldering te doen, en zal co-elutie niet zo'n rol meer spelen vanwege de selectiviteit van MSMS. Als de standaarden eenzelfde MSMS spectrum geven op dezelfde retentietijd, dan ben je er........

Het lijkt me in ieder geval nuttig dat Beaker zelf weer eens in deze discussie springt om ons wat meer details te verschaffen over welke apparatuur hij tot zijn beschikking heeft - type LC, type MS, doel van het experiment: kwantitatief, kwalitaief?- voordat we verder gaan .........

En nogmaals, Napoleon1981, ik bestrijdt je inzichten niet en zal zeker het nut vsn nanoLC niet bagatelliseren, maar heb gewoon andere inzichten dan jij, en dat mag.

Eric

Piek verbreding blijf je inderdaad houden, maar zal niet verergen zoals jij suggereert (weer verdraai je het). Verder nogmaals. Je kunt een stof parkeren op een kolom voor 100 jaar en dan in een naald er af krijgen met een gradient, nogmaals lees de theorien maar eens. Ik probeer helemaal geen geloof te verkondigen, ik ga alleen in op onwaarheden die verkondigt worden. Oh en je hoeft helemaal niet op mij in te gaan. Was jij niet de gene die voorstelde Beaker te laten kiezen wat hij wilde? Ik doe mijn verhaal en jij doet jouw verhaal. Lijkt mij prima trouwens als je niet meer op mij reageert even goede vrienden .

Edit: En over je het nanoLC gebeuren geldt hetzelfde, ik draag wat oplossingen aan en dan kan Beaker zelf kiezen. Uit persoonlijke ervaring kan ik je vertellen dat ik graag alle oplossingen op tafel heb wanneer er een beslissing genomen moet worden.

Beste Napoleon 1981,

Piekverbreding blijf je houden. Dit fenomeen zal altijd een rol blijven spelen, ook bij gradientelutie. Dit is een fysich gegeven, en dat weet jij ook wel. Jij hebt het telkens over lange kolommen, maar wat bedoel je eigenlijk? Met lange kolommen bedoel ik zoiets als 30cm*4.6mm gepakt. Hebben we het eigenlijk wel over hetzelfde? Ik bestrijdt ook niet de superiotiteit van nanoLC voor wat betreft chromatografische performance, maar ik ben alleen van mening dat, gezien het analyseprobleem, de zaken niet ingewikkelder moet maken dan ze zijn. Feit is dat in de handen van de gemiddelde chromatografist, nanoLC een techniek is die in ieder geval geleerd moet worden, en niet de meest voor de hand liggende oplossing is. Verder is het waarschijnlijker dat Beaker in zijn lab conventionele HPLC en APCI tot zijn beschikking heeft, dan een capillaire LC met bijbehorende kolommen. Mijn suggesties zijn meer ingegeven door ''roeien met de riemen die je hebt'' dan door optimale analytische performance. Ik probeer een probleem op te lossen, maar ik krijg meer en meer de indruk dat jij een geloof probeert te verkondigen. Dit beweegt me ertoe om maar verder niet meer te reageren op jouw onbenullige schrijfsels die er alleen maar op gericht zijn om gelijk te krijgen. Net als bij Jehovah getuigen op zondagmorgen is het maar het beste om de deur gewoon dicht te doen en maar niet meer te reageren...........

Ik hou zelf van iets wat Amerikanen "thinking out of the box" noemen. Dus niet het wiel opnieuw uit proberen te vinden, en lessen die geleerd worden in andere vakgebieden gewoon implementeren. In proteomics heeft men te maken met complexe samples en dit is ook het sample dat beaker beschrijft, er is dus meer overlap dan je denkt.

Verder suggereer jij piek verbreding, iets wat complete onzin is en juist het omgekeerde vind plaats. Laten we het nou gewoon noemen zoals het is (je zit er in je vorige post compleet naast) en niet weg wuiven............

Ik wou dat mensen op forums gewoon eens een fout toegeven ipv van het topic weer proberen weg te sturen van de richting waar ze het zelf ingestuurd hebben.

Hoe dan ook, inmiddels beginnen we af te dwalen van de oorspronkelijke vraag over ion suppressie, en over piekverbreding kunnen we een aparte topic makkelijk gedurende lange tijd vullen. Meterslange kolommen kunnen dan in de proteomics ganbaar zijn; de analyse van azo-kleurstoffen is niet bepaald een proteomics probleem.

Ik blijf bij mijn laatste suggestie, en misschien moeten we het maar aan Beaker laten welke suggesties hij/zij ter harte neemt. Akkoord?

eric van der meulen schreef: Ook in de analytische chemie is het resultaat niet alleen afhankelijk van de lengte van je kolom  Het gaat natuurlijk om resolutie. Een lange kolom met een langzame gradient is een manier om goede scheiding te bereiken, maar dit gaat ten koste van je detectiegrens (door piekverbreding) en analysetijd. De trend is juist tegenwoordig om de lengte van de kolom te beperken en de deeltjesdiameter van de kolompakking omlaag te brengen. De meeste LC fabrikanten brengen tegenwoordig LC pompen op de markt die de hoge druk aankunnen die kolommen met kleine deeltjesdiameters <2 um veroorzaken. De lengte van de kolommen blijft dan meestal beperkt tot 5-10 cm en een diameter van 2-4 mm. Analysetijden <2 min zijn dan geen uitzondering en de resolutie is veel beter dan bij conventionele LC.

Wat een onzin piek verbreding. Het aantal schotels dus EFFICIENTY heeft de volgende relatie: Efficienty verhoging gaat met de factor wortel van de lengte, niks piekverbreding dus maar meer efficienty zelfs. Om de relatie nog even te vertalen je hebt 4x zo'n lange kolom nodig om 2 keer de efficienty te krijgen. Mensen gebruiken niet voor niks meter lange kolommen in de proteomics.

Piek verbreding in gradient elutie? In gradient elutie krijg je naalden, heb je wel eens naar de theorieen gradient elutie gelezen van Poppe en Knox etc?

En de trend is dus lange capillaire kolommen wanneer matrix effects optreden[;)] Kijk maar naar het werk van Richard D Smith, Jorgenson etc.

[QUOTE]koop dan niet zo'n korte mass spec kolom, maar een kolom met wat lengte.

Ook in de analytische chemie is het resultaat niet alleen afhankelijk van de lengte van je kolom Het gaat natuurlijk om resolutie. Een lange kolom met een langzame gradient is een manier om goede scheiding te bereiken, maar dit gaat ten koste van je detectiegrens (door piekverbreding) en analysetijd. De trend is juist tegenwoordig om de lengte van de kolom te beperken en de deeltjesdiameter van de kolompakking omlaag te brengen. De meeste LC fabrikanten brengen tegenwoordig LC pompen op de markt die de hoge druk aankunnen die kolommen met kleine deeltjesdiameters <2 um veroorzaken. De lengte van de kolommen blijft dan meestal beperkt tot 5-10 cm en een diameter van 2-4 mm. Analysetijden <2 min zijn dan geen uitzondering en de resolutie is veel beter dan bij conventionele LC.

Maar voor de toepassing van Beaker zou ik beginnen met een ''standaard'' LC kolom: lengte ~10cm, C18, deeltjesdiameter 3-5 um. Voor wat betreft de kolomdiameter is het inderdaad zo dat een kleine diameter de resolutie verbetert, maar de belaadbaarheid wordt natuurlijk dan wel kleiner. Conventionele kolommen zijn meestal verkrijgbaar vanaf 1 mm, en dit werkt in mijn ervaring heel goed.

eric van der meulen schreef: Om het hele probleem van ion supressie te omzeilen zou je natuurlijk ook APCI in plaats van ESI kunnen doen. Een voorwaarde hiervoor is dat je verbindingen thermisch stabiel genoeg zijn, maar dit is een kwestie van proberen. Je hebt met APCI in ieder geval geen/veel minder last van ion supression, en een APCI source is voor beginners gemakkelijker in gebruik en robuuster dan een nanospray bron. Napoleon 1981 zegt dat voor hem nanospray geen problemen oplevert, maar mijn ervaring is anders.....waarschijnlijk heeft hij het door dagelijks gebruik goed in de vingers, maar hij werkt dan ook in ''de proteomics'', en daar is nanospry veel meer ingeburgerd dan bij ''small molecules''. Experimenten met nanospray (met flowspiltter en getrokken, gecoate capillaire tips) waren bij ons in ieder geval geen denderend succes....... Ik was echter wel erg onder de indruk van het bedieningsgemak van eerder genoemd apparaat (fractiecollectie gevolg door infusie). Misschien is dit ook iets voor Napoleon 1981 om naar te kijken? Maar dit zou een aparte topic kunnen zijn........

APCI dus.......probeer het eens (als je tenminste een APCI bron hebt). Ion supressie speelt hierbij een veel mindere rol dan bij ESI. SPE (ik sluit me aan bij bteunissen) gecombineerd met APCI zou wel eens niet zo'n slechte oplossing kunnen zijn.

Been there done that, kan alleen maar zeggen er is niet voor niets een reden dat dit niet de meest gangbare oplossing is . Dan spreek ik niet in termen van het online gebruikers gemak, maar intermen van gevoeligheid, peak capacity etc.

Maargoed beaker, ik denk dat je met een hoogwaardige LC kolom en een goede scheiding niet zoveel last van matrix effects zult hebben. Probeer een langzame gradient elutie en koop dan niet zo'n korte mass spec kolom, maar een kolom met wat lengte. Kleine diameter is makkelijk zodat je de flow wat terug kan schroeven.