door Jooken » zo 17 okt 2010, 14:39
Ik kan geen betrouwbare pKa waarde van caffeine vinden, maar aan de structuur te zien moet het een zeer zwakke base zijn (in een compilatie vond ik de waarde van 0,62 ; maar ik kan de originele referentie niet traceren).
Wanneer je de retentietijd van een zwakke base plot als functie van de pH (bij constant % organische modifier), dan bekom je een sigmoïde curve, zoals een titratiecurve, met een kleine retentietijd bij lage pH, en een hoge retentietijd bij hoge pH. Het buigpunt ligt bij ongeveer de pH = pKa. Voor caffeine zou dat betekenen dat de pH zeer laag moet zijn om de retentietijd substantieel te verkorten. Een dergelijk lage pH zal je kolom nooit overleven. Ik zou er gewoon op gokken dat de retentietijd van caffeine onafhankelijk is van de pH, binnen redelijke grenzen.
Paracetamol daarentegen is een fenol, en dus een zwak zuur. Hier is het wel gewenst om de pH van de mobiele fase te controleren, al is het maar om een reproduceerbare retentietijd te krijgen.
Voor de optimalisering van het chromatogram zou ik een standaard aanmaken met paracetamol en caffeine, waarin een duidelijk verschil in piekgrootte is. Hierdoor kan je op het zicht zien wat wat is.
Voor de mobiele fase gebruik je 1% azijnzuur (AcOH) in water en methanol. Neem nu een reeks isocratische chromatogrammen met 100 - 80 - 60 - 40 - ... % MeOH totdat de retentie goed is (de retentiefcator k tussen 2 en 10). Ik verwacht dat beide pieken dan ook gescheiden zullen zijn. Voor een 2,1 mm diameter kolom kan je een debiet instellen van 0,3 mL/min. Kies dan een % MeOH zodat de resolutie 1,5 tot 2 is. Meer is zeker niet nodig. De detectiegolflengte kies je als 254 nm of iets in die buurt.
Voor de finetuning kan je het debiet opdrijven. Dit verkort de retentietijd, terwijl voor een 3 µm kolom de kolomefficiëntie en dus ook de resolutie niet veel zal afnemen (voor 3µm deeltjes verloopt de Van Deemtercurve zeer vlak voorbij het optimum). Verhoog het debiet totdat je aan de maximale druk zit die je systeem aankan, met een veilige marge (naarmate een kolom langer in gebruik is, zal de tegendruk stijgen).
Op die manier krijg je een zeer snelle scheiding, zonder dat dit zeer veel experimenteertijd kost. Ik schat dat het niet meer dan een halve tot een hele dag tijd kost om deze scheiding te optimaliseren.
Ik kan geen betrouwbare pKa waarde van caffeine vinden, maar aan de structuur te zien moet het een zeer zwakke base zijn (in een compilatie vond ik de waarde van 0,62 ; maar ik kan de originele referentie niet traceren).
Wanneer je de retentietijd van een zwakke base plot als functie van de pH (bij constant % organische modifier), dan bekom je een sigmoïde curve, zoals een titratiecurve, met een kleine retentietijd bij lage pH, en een hoge retentietijd bij hoge pH. Het buigpunt ligt bij ongeveer de pH = pKa. Voor caffeine zou dat betekenen dat de pH zeer laag moet zijn om de retentietijd substantieel te verkorten. Een dergelijk lage pH zal je kolom nooit overleven. Ik zou er gewoon op gokken dat de retentietijd van caffeine onafhankelijk is van de pH, binnen redelijke grenzen.
Paracetamol daarentegen is een fenol, en dus een zwak zuur. Hier is het wel gewenst om de pH van de mobiele fase te controleren, al is het maar om een reproduceerbare retentietijd te krijgen.
Voor de optimalisering van het chromatogram zou ik een standaard aanmaken met paracetamol en caffeine, waarin een duidelijk verschil in piekgrootte is. Hierdoor kan je op het zicht zien wat wat is.
Voor de mobiele fase gebruik je 1% azijnzuur (AcOH) in water en methanol. Neem nu een reeks isocratische chromatogrammen met 100 - 80 - 60 - 40 - ... % MeOH totdat de retentie goed is (de retentiefcator k tussen 2 en 10). Ik verwacht dat beide pieken dan ook gescheiden zullen zijn. Voor een 2,1 mm diameter kolom kan je een debiet instellen van 0,3 mL/min. Kies dan een % MeOH zodat de resolutie 1,5 tot 2 is. Meer is zeker niet nodig. De detectiegolflengte kies je als 254 nm of iets in die buurt.
Voor de finetuning kan je het debiet opdrijven. Dit verkort de retentietijd, terwijl voor een 3 µm kolom de kolomefficiëntie en dus ook de resolutie niet veel zal afnemen (voor 3µm deeltjes verloopt de Van Deemtercurve zeer vlak voorbij het optimum). Verhoog het debiet totdat je aan de maximale druk zit die je systeem aankan, met een veilige marge (naarmate een kolom langer in gebruik is, zal de tegendruk stijgen).
Op die manier krijg je een zeer snelle scheiding, zonder dat dit zeer veel experimenteertijd kost. Ik schat dat het niet meer dan een halve tot een hele dag tijd kost om deze scheiding te optimaliseren.
