Bloedcellen bekijken - welke kleurstof?

[Appeltaart123]

Zoals de titel al aangeeft.. welke kleurstof kan ik het beste gebruiken om bloedcellen te bekijken onder de microscoop?
 
Of is daar geen kleurstof voor nodig? Wil het in helderveld modus bekijken 1000x vergroot zowel witte- als rode bloedcellen.
 
En welke kleurstof kan ik het beste gebruiken om bacteria in te kleuren?

[Benm]

Dat hangt er een beetje vanaf. Bloedcellen kun je zien onder een microscoop, rode bloedcellen hebben kleur, en de celwanden en dergelijke van witte bloedcellen geven een beetje beeld doordat hun brekingsindex niet gelijk is aan de omgeving. Als je een fasecontrast microscoop hebt kun je die celwanden en organellen een stuk beter zien.

Normaliter kleur je samples bloed met HE stain, dat bevat 2 stoffen waarvan een de kernen paars maakt en de ander eiwitten roze/rood.

[Appeltaart123]

Ik heb een fase-contrast microscoop tot x40 , heb er nu een x100 bij besteld (helderveld) met de hoop meer te kunnen inzoomen op bloedcellen. Dit is een olie immersie objectief. Was even benieuwd welke kleurstoffen ik er het beste bij kan halen. De microscoop is trouwen een prof, geen speelgoed oid.
 
Heb er ook een 5mp camera bij , zal binnenkort wel wat leuke plaatjes posten : )

[Benm]

Zonder kleuring denk ik dat je met die 40x fasecontrast meer zult zien dan met de 100x helderveld microscoop. Uiteraard is de de vergroting in het eerste geval wat lager, maar fasecontrast maakt echt een spectaculair verschil voor transparante monsters.

Als je je monsters gaat kleuren heb je dat fasecontrast niet meer zo hard nodig en is de vergroting wellicht een belangrijker argument. Voor bloed en meercelling weefsel lijkt me hematoxyline-eosinekleuring de beste aanpak. Als je naar bacterien oid wilt kijken kun je wellicht aan de slag met gram kleuring.

[Yvan_be]

In het lab worden bloeduitstrijken traditioneel gekleurd met zgn. Romanovsky-kleurstoffen. Dat zijn bijzonder complexe mengsels van methyleenblauw en methyleenblauw-eosinaten, ontwikkeld om zoveel mogelijk componenten in het bloedbeeld zichtbaar te maken. Daarbij geldt dat basofiele structuren blauw gekleurd worden, acidofiele rood.
In Europa is de vaakst gebruikte kleurtechniek die met May-Grünwald/Giemsa, de Angelsaksische wereld zweert dan weer bij Wright.
 
Aan de kleurstofoplossingen naar May-Grünwald en Giemsa is wellicht nog eenvoudig te komen (kijk eens vriendelijk naar de apoteker, die kan het bestellen). Hou er wel rekening mee, dat de oplossingen, eens de flesjes geopend, beperkt houdbaar zijn.
Werkwijze is als volgt:
 
- maak een (dunne) uitsrijk en laat drogen
- druppel op de uitstrijk May-Grünwald tot de uitstrijk volledig bedekt is. De methylalcohol fixeert de uitstrijk. Laat inwerken gedurende 1 min
- druppel op de uitstrijk evenveel (en even grote) druppels gedestileerd/gedeïoniseerd water (of beter: buffer pH 6,8-7) als druppels May-Grünwald. Meng door het glaasje zachtjes te bewegen. De kleurstoffen worden vrijgesteld. Er mogen geen neerslagen optreden! Laat 1 min inwerken
- verdun ondertussen Giemsa-stamoplossing a rato van 1 druppel per ml gedestileerd/gedeïoniseerd water (of beter: buffer pH 6,8-7)
- giet de May-Grünwald-oplossing af en bedek de uitstrijk met Giemsa. Tussendoor spoelen is niet nodig. Laat 5 à 10 min inwerken
- spoel voorzichtig met gedestileerd/gedeïoniseerd water, laat aflekken en drogen. Onderzoek met een immersieobjectief. Of sluit in met paraffine-olie en onderzoek met een sterk droog objectief.
 
Overigens is het zeer de moeite om eens een druppeltje levend bloed te onderzoeken. Natuurlijk gaat dat beter met geavanceerde waarnemingsmethoden zoals donkerveld, fasecontrast, anoptralcontrast, DIC enzovoort, maar met eenvoudige middelen, zoals scheve verlichting en dichtgeknepen apertuurdiafragma gaat het ook... Het beeld is dermate spectaculair, dat het aanleiding gegeven heeft tot een nieuwe kwakreligie: de "Levend Bloed Analyse", kortweg LBA .

[Yvan_be]

[...]
 
En welke kleurstof kan ik het beste gebruiken om bacteria in te kleuren?

 
Om het even welke basische kleurstof. Kies maar: methyleenblauw, safranine, kristalviolet, gentiaanviolet, om het even welke hematoxyline, basische fuchsine, malachiegroen... de lijst is eindeloos.
 
Gramkleuring lijkt eenvoudig en verwordt in sommige fora tot een modieuze kreet , maar de techniek is minder eenvoudig dan hij lijkt.
Het protocol is aan strikte voorwaarden gebonden wat zowel de stalen als de uitvoering betreft, wil men enigszins relevant resultaat.
Daarbij lijken sommigen, op sommige fora, te suggereren, dat, met het resultaat van een Gramkleuring het "beestje" al zo goed als gedetermineerd is... Was het maar waar!
Het enige wat een Gramkleuring doet is de bacteriën onderverdelen in twee grote groepen. Da's alles. Morfologie, Gramgedrag en oorsprong van het materiaal geven een grove indikatie van "wat het misschien zou kunnen zijn". De kans dat streptokokken uit pus Streptococcus thermophilus zijn, is nu eenmaal gering.
Determinatie gebeurt door onderzoek van het metabolisme middels uitplaten van reinculturen op selectieve bodems.
Het moge duidelijk zijn, dat dat geen klusjes zijn die je even klaart aan het aanrecht...
Zeker als er dan een broedstoofje bijkomt en men begint te kweken binnen het temperatuurtraject 35 - 45°C, kunnen de zaken ronduit gevaarlijk worden! En veel sneller dan men denkt. Geen aanrader, dus...

[Yvan_be]

In een bijzonder interessant artikel in Micscape Magazine van deze maand, beschrijft Chris Thomas een eenvoudige methode voor het kleuren van bloeduitstrijken. Gekleurd wordt met "Parker black Quink" vulpeninkt, zie: http://www.microscopy-uk.org.uk/mag/artsep15/ct-Quink-blood-stain.pdf