Analysemethode aminozuren (Miller-Urey experiment)

[HeisenbergNL]

Goedendag,
 
 
Voor mijn profielwerkstuk ga ik onderzoek doen naar de vorming van aminozuren in de oer-atmosfeer. De meesten onder ons zullen dit waarschijnlijk kennen als het Miller-Urey experiment. In een notendop: ik ga onderzoeken of er aminozuren gevormd hadden kunnen worden uit gassen en bliksem, rond het Hadean/Eoarchean tijdperk. De opstelling zelf heb ik al gebouwd en de planning is om maandag 14-2 te beginnen met de eerste run.
 
Ik heb deze vraag in de categorie Analytische chemie geplaatst omdat dit denk ik meer richting de echte chemie gaat dan een vraag voor school over mol verhoudingen etc. Het is ook niet per se een project voor mijn profielwerkstuk, ik wilde dit experiment ooit een keer zelf uitvoeren, dus dit kwam gewoon goed uit.
 
Na een week zal ik een monster nemen van de vloeistof in de kolf, waar waarschijnlijk aminozuren zullen worden aangetroffen. Om dit aan te tonen zal ik gebruik gaan maken van papier-chromatografie. Helaas kan je hier niet precies mee aflezen welke stoffen er zijn gevormd in welke hoeveelheden.
 
Om deze reden zoek ik naar een methode waarmee ik de vloeistof goed kan analyseren en kan aflezen welke stoffen zijn gevormd. Zelf ben ik bijvoorbeeld al HPLC tegengekomen toen ik hier op zocht. Helaas kon ik niet duidelijk vinden op welke manier ik het daarmee het beste kon meten (UV, fluorescentie) etc. 
 
Zelf weet ik niet heel veel af van analytische chemie/HPLC of hoe je precies alles kan analyseren. Ik vraag hierom dan ook of iemand mij kan helpen met het zoeken naar een analysemethode die goed zal passen bij mijn experiment.
 
Bij HPLC heb ik gezien dat er na een bepaalde tijd pieken ontstaan die overeenkomen met een bepaalde hoeveelheid stof. Mijn vraag is hierbij hoe je kan zien welke piek bij welke stof hoort en of je op deze manier ook kan zien welke stof het is, als het onbekend is welke stoffen aanwezig zijn, of dat HPLC slechts goed is voor kwantitatieve bepaling. Verder zag ik nog massa-, IR en UV-spectrometrie, al heb ik nog niet de tijd gehad om meer hierover uit te zoeken.
 
Ik ben dus op zoek naar de beste manier om te bepalen welke aminozuren aanwezig zijn in een oplossing (en eventueel welke hoeveelheid) en waar ik dit eventueel zou kunnen doen/waar de benodigde apparatuur beschikbaar is/hoe duur het zou zijn om te kopen. Zelf woon ik erg dicht bij de TU Delft dus ik zou daar eventueel contact mee kunnen opnemen. Als de apparatuur niet te duur is bestaat de mogelijkheid dat mijn school het kan kopen om in de toekomst bij andere experimenten te gebruiken.
 
Voor vragen over het profielwerkstuk of de opstelling kan je natuurlijk altijd een pb sturen. 
 
Alvast bedankt voor de hulp!
 
 
Met vriendelijke groet,
Luciano Nooijen
 
(Too long; didn't read:
Ik ben op zoek naar een manier om te bepalen welke aminozuren aanwezig zijn in een oplossing.)

 

[NW_]

Hallo,
 
Dit ziet er een interessant onderwerp uit. Over de achtergrond kan ik je helaas niet veel verder helpen, maar ik weet wel wat meer ivm de detectie van je aminozuren. Ik raad je aan om de analysen met HPLC uit te voeren. Andere methodes (UV- IR spectroscopie...) zijn niet erg handig hiervoor. Werken met een HPLC / HPLC-MS is niet zo eenvoudig, zeker als je dit nog nooit eerder hebt gedaan. Vraag hiervoor zeker hulp van iemand die met dit toestel kan werken.
 
Een korte uitleg ivm HPLC/ HPLC-MS:
 
HPLC is een chromatografische techniek, die bij uitstek geschikt is voor de analyse van polaire, niet vluchtige componenten. Zeer eenvoudig voorgesteld, wordt een vloeistofmengsel doorheen een kolom gestuurd, die een zekere vulling (zeer kleine korrels met een dunne vloeistoffilm) bevat. Dit wordt de stationaire fase genoemd. De verschillende componenten aanwezig in je vloeistofmengsel zullen, afhankelijk van hun fysicochemische eigenschappen , op verschillende wijzen in interactie treden met de stationaire fase. Uiteindelijk zullen de componenten de kolom op verschillende tijdstippen (= retentietijden) verlaten. Bij het verlaten van de chromatografische kolom, worden de componenten geregistreerd d.m.v. een detector. Bij HPLC is dit meestal een UV detector, maar er bestaan ook andere detectoren.  Als resultaat verkrijg je een "chromatogram". Dit is een figuur, waarbij de detectorrespons geplot wordt ifv de retentietijd. Visueel komt dit er op neer dat er een aantal pieken terug te vinden zijn op het chromatogram.
 
Het grote probleem van HPLC met UV, en een aantal andere detectoren, is dat je niet kunt zeggen welke componenten je terug te vinden zijn. Je ziet weliswaar een aantal pieken, maar niet met welke componenten deze overeenkomen. Om de aanwezige component te kwalificeren, is enige kennis noodzakelijk uit de literatuur.
 
Indien je uit de literatuur weet welke componenten aanwezig zijn, dan kun je voor elke mogelijks aanwezige component een standaardoplossing maken, en ze één voor één injecteren op de HPLC. Indien de geïnjecteerde standaard overeenkomt met een component aanwezig in het monster, dan kun je dit zien aan de retentietijden. Deze moeten voor de component in het staal en de standaard identiek zijn.
 
Nadeel aan deze procedure is dat ze nogal wat tijd vergt. Een oplossing kan zijn om gebruik te maken van HPLC-MS. Bij HPLC-MS wordt na de chromatografische kolom een massaspectrometer geplaatst. In de massaspectrometer worden de inkomende moleculen geïoniseerd, en vervolgens gefragmenteerd door bvb. een elektronenbombardement. Hierdoor zal je oorspronkelijk moleculen opgesplitst worden in een aantal stukken ("fragmenten").  Door registratie van de gevormde fragmenten zal de massaspectrometer je kunnen vertellen welke molecule er voor welke piek aanwezig is.
 
Indien je na kwalificatie weet welke componenten aanwezig zijn, kun je overgaan tot kwantificatie. Maak hiervoor een mengstandaard die alle componenten bevat waarvoor je de concentratie in de stalen wilt kennen. Maak vervolgens uitgaande van de stockoplossing een aantal verdunningen (idealiter een 8-tal ) en injecteer deze op de HPLC. Zet vervolgens voor elke component de respons (piekoppervlakte) uit in functie van de concentratie. Door lineaire fitting kun je het verband tussen concentratie en respons terug vinden. Daarna injecteer je uw stalen. Uitgaande van de gemeten respons kun je de concentratie van de componenten bepalen.

[Marko]

HPLC is een geschikte techniek, maar is, net als TLC, een scheidingstechniek. Elke component komt op een karakteristiek tijdstip uit de kolom, en als je een referentie hebt (een analyse waarvan je weet dat het aminozuur X of Y is) kun je aan ieder aminozuur een tijdstip koppelen. Maar zonder referentie wordt het lastig. Een UV of fluorescentiedetector kan je (nagenoeg) niets vertellen over de structuur van de stof die op een gegeven tijdstip langskomt.
 
De enige detector waar dat wel mee kan is een MS, maar LC-MS systemen zijn duur en worden daarom ook niet zomaar ter beschikking gesteld voor "derden".
 
Voor je gaat nadenken over de analyse denk ik dat je ook nog even een paar zaken moet afstemmen over de uitvoering. Ik weet natuurlijk niet welk "recept" je precies gaat gebruiken (Miller heeft een heel scala geprobeerd) maar ik vind het nog niet zo voor de hand liggen dat iemand op een middelbare school vonkjes gaat lopen maken in een kolf met onder andere methaan en waterstof. Kijk ook even hier: http://www.jove.com/video/51039/conducting-miller-urey-experiments 

[HeisenbergNL]

Bedankt voor jullie reacties. 
 
Ik zal kijken of het mogelijk is om mbv HPLC te analyseren welke stoffen aanwezig zijn. Ik zal nog even met mijn scheikundeleraar overleggen of het een goed idee is om universiteiten te benaderen.
 
Marko, ik begrijp dat je zo je twijfels hebt over veiligheid etc. Ik zal het experiment twee maal uitvoeren. Een met zwavelhoudende gassen en de andere zonder. De gehele opstelling staat in een zuurkast en zal daar ook in blijven staan. Omdat het niet mogelijk is om hier op school een geheel zuurstofloze atmosfeer te creëren zal ik dan ook waarschijnlijk geen waterstofgas gebruiken. Gelukkig is dit ook geen heel groot probleem aangezien het waterstofgas al "snel" verdwenen was uit de oer-atmosfeer.  Methaan zal ik wel gebruiken.
 
Eerst zal ik het hele systeem flushen met CO2 of N2 waarna ik mbv ballonnen de gewenste mix in het systeem breng. Hierbij zal er misschien een beetje zuurstof in het systeem komen, echter hoop ik dit met goede voorbereiding en snel handelen tot een minimum te beperken waardoor het zuurstofgehalte ruim onder 1% procent zal zijn, waarschijnlijk zelfs onder de 0.5% of lager. Alles (behalve de aansluitingen voor elektrodes) is met slijpstukken die ik met clips vast zal zetten en in zal smeren met siliconen. Voor overdruk heb ik een slang vastgemaakt aan een thermometeraansluiting en deze uit laten komen in een erlenmeyer met gedestilleerd water waardoor bij onderdruk gewoon water erin zal worden gezogen en bij overdruk lucht zal ontsnappen zonder dat er zuurstof in het systeem zal komen. 
 
Mocht je nog vragen hebben graag de opstelling zien dan kan je me een berichtje sturen, dan stuur ik je wel een foto ervan.

[Marko]

Je hebt m'n twijfels weggenomen! Het ziet eruit als een gedegen voorbereiding. 
Zonder waterstof scheelt al een hoop, de bovenste explosiegrens van methaan ligt een stuk lager, dus is de aanwezigheid van zuurstof minder kritisch.
 
Succes met de uitvoering. Het zou geweldig zijn als je daadwerkelijk enkele aminozuren kunt detecteren!