Ontwikkelen ELISA tests

[Danoontje]

Beste heren en mevrouwen

Voor school moet ik een stuk schrijven over de productie van ELISA testkits. Of ja, moet, dat wil ik

Echter valt op internet en pubmed e.d. erg weinig te vinden over de presize methode van ELISA testkit productie. Nu heb ik voor mijzelf al enkele stappen (korte stappen en erg globaal) onder elkaar gezet om op zijn minst een idee te krijgen.

Maar ik vroeg mij af of iemand mij specifiekere informatie kon geven.

Stel je wilt dmv van een ELISA test besmetting van een dier aantonen door bijv een bepaald virus. Met de elisa test kun je dan de antilichamen in het bloed tegen het specifieke antigen aantonen.

De procedure van ELISA uitvoeren is

Cups zijn gecoat met specifieke antigenen

Antilichamen uit het bloed moeten dan aan deze antigenen binden.

Daarna wordt (na was stappen) conjugaat toegevoegd. In dit conjugaat zitten "antilichaam-antilichamen" welke gelabeld zijn. Deze antilichamen zijn deze weer specifiek voor het gebonden antilichaam uit het bloed? Of zijn dit min of meer universele antilichamen welke eigenlijk aan álle antilichamen zouden binden (indien deze aanwezig waren)

De rest van de procedure is mij geheel duidelijk (klopt ik ben langzaam overgegaan niet het uitvoeren van de test ivm de productie )

Hier rijzen echter voor mij ONTZETTEND veel vragen

1 - wat als de benodigde antigenen niet zomaar te verkrijgen zijn? Zijn er dan bedrijven welke deze kunnen produceren? Of is dit met de juiste apparatuur zelf mogelijk? Zijn hier ook protocollen voor? (en zo ja: waar?). Dus hoe isoleer en produceert men antigenen?

2 - de gelabelde antilichamen uit het conjugaat binden aan de antilichamen uit het bloed. Deze gelabelde antilichamen zijn deze specifiek? of universeel?

3 - is het mogelijk om bijv een cup te coaten met antigenen uit een vaccin? Om zo vaccinatie aan te tonen?

4 - sommige testkits kunnen onderscheid in antilichamen door vaccinatie en antilichamen door natuurlijke besmetting aantonen. Hoe gaat dit in zijn werk?

Er zijn nog veeeel meer vragen die mij nu even niet te binnen schieten. Maar ik ben eigenlijk dusdanig gebiologeerd door dit geheel dat ik gewoon álles wil weten (zonder het inprincipe toe doet voor mijn verslag)...is er ergens goede vakliteratuur te koop? Of iets dergelijks?

Ik heb wel diverse protocollen voor ELISA productie gevonden, echter behandelen deze mijn vragen niet...ze zijn té oppervlakkig en gaat er vanuit dat de je al over de antigenen beschikt.

Ik zou het ontzettend op prijs stellen als u mij zou willen helpen!!

[Dr.Chemo]

Eerst en vooral zijn er verschillende soorten ELISA-methoden, namelijk de sandwich en competitieve methode. Deze kunnen direct of indirect gebeuren.

Het conjugaat dat je toevoegt bestaat uit peroxidase enzym en nadien dmv substraat/chromogeen toe te voegen, wordt er een gekleurd complex gevormd.

Bij indirecte ELISA is er een antilichaam-antilichaam met PO conjugaat dat bindt aan het antigen op de bodem van de well. Bij directe ELISA alleen het AL-PO conjugaat dat bindt.

Bij competitie ELSISA bindt het conjugaat ALLEEN met de extra toegevoegde antigenen. De andere ( te onderzoeken antigenen blijven hiermee ongebonden). Dit is ineens het verschil tussen competitie en sandwich ELISA ( hun curve is tegengesteld S-vormig ).

Dit is toch al een stuk antwoord op je vraagjes ...

[Danoontje]

Hoi, hartelijk bedankt voor uw antwoord. Deze informatie kende ik alleen al

Bij niet competitieve Elisa is de mate van kleuring een standaard voor de aanwezigheid van antilichamen in het bloed/serum. Sterkere kleuring betekend meer AL.

Bij competitieve Elisa is dit weer andersom, hoe minder kleuring, hoe minder PO conjugaat gebonden is en dus hoe méér AL aanwezig in bloed of serum

Echter weet ik (helaas) nog niets over de ontwikkeling van deze test...

- antigenen om cup te coaten: hoe isoleert, zuivert en vermenigvuldigd men deze

- antilichamen in het conjugaat, zijn dit (bij niet competitieve elisa) gewoon standaard AL-antilichamen, of zijn deze ook weer op hun beurt specifiek voor de antilichamen uit het bloed/serum

- bij competitieve elisa moet het antilichaam uit het bloed in principe een minimale voorrang hebben bij binden aan de antigenen in de cup tov de AL-PO. Hoe doet met dit? Ik neem aan dat het min-of-meer dezelfde antilichamen zijn (ene wel gelabeld met per enzym)?

Zo rijzen er bij mij nog wel meer vragen. Helaas ben ik erg nieuwsgierig

[Gerard]

Hallo Daniel,

J e kent het gezegde 1 gek kan meer vragen dan 10 wijzen kunnen beantwoorden, hier heb je van die vragen.

Ik heb zeer beperkte ervaring met het opzetten van elisa's maar er staan 4 dikke handboeken op de plank om allerlei procedures uit te putten zeker als het een kwantitatieve test moet worden kost het ongelooflijk veel werk.

Een simpel eerste stap het meten van een antistof in bloed.

Laten we eens uitgaan dat we iemand willen testen op een allergie op graspollen(hooikoorts) of pinda's

Startmateriaal pinda's koop je zo in de winkel, graspollen kun je kopen bij gespecialiseerde firma's die deze pollen verzamelen tijdens de bloei.

Nu moet je allergeen preparaat maken door de eiwitten uit het startmateriaal te halen, vooronderstelling alleen de wateroplosbare eiwitten zorgen voor allergie.

Pollen kun je dus met een buffer extraheren en het extract kun je direct gebruiken voor de elisa, pinda,s geven al extra problemen want die moet je eerst malen en de vetten extraheren, en dan de eiwitten met een buffer eruithalen.

Met een eiwit bepaling en electroforese met een eiwitkleuring kun nu een optimalisatie van je extracties doorvoeren.

Nu moet je gaan uitzoeken onder welke condities je allergeenextracten aan de microtiterplaten kunt koppelen, dus welk soort plaat, welke buffers en welke verdunning van je allergeen extract

Nu heb je dus een plaat met gekoppelde allergenen waarmee antilichamen in serum (IgE immonoglobulinen) kunt binden, vervolgens kun je met in bv in een konijn geproduceerde anti-humaan IgE eiwitten gekoppeld aan een enzym de concentratie bepalen.

Nu komen er een heleboel stappen om de bepaling te optimaliseren en robuust te maken, met daarnaast controles op de allergeengehaltes van je extracten.

[Danoontje]

danku danku. Ik begrijp dat het ontzettend ingewikkeld en tijdrovend is. Maar voor een verslag is dat niet echt van belang Ik wil eigenlijk gewoon de theoretische achtergrond begrijpen (en natuurlijk spelen praktische aspecten een ontzettend belangrijke rol daarbij).

Stiekem vind ik het erg jammer dat u allergenen als voorbeeld gebruikt. Ik wilde mijn verslag nl baseren op een virale infectie. Dus een virus treedt het lichaam binnen. Zover ik weet zijn er dan 2 opties:

1. Het lichaam produceerd antilichamen tegen het virus zelf

2. Het lichaam produceerd antilichamen tegen de geinfecteerde cellen (deze veranderen van uiterelijke kenmerk waardoor ze herkent wordt als zijnde geïnfecteerd)

(correctie me if I'm wrong )

Graspollen is dus stiekem een makkelijkere versie dan waar k op doelde (desalniettemin stel ik uw reactie erg op prijs! ).

Maar mijn probleem is dus: je hebt een virus, noem hem voor de grap "virus XYZ". Dit virus treedt het lichaam binnen en het immuunsysteem reageert hierop (zie de 2 opties hierboven omschreven).

Het cupje moet dan gecoat zijn met óf het virus XYZ óf met de bindingsplekken op de geinfecteerde cellen. toch? Dus deze moeten geïsoleerd worden uit een positief bloedmonster. Of is het mogelijk om een vaccinatie voor virus XYZ hiervoor te gebruiken (Deze heeft dezelfde antigenen (deels gemodificeerd maar ok)?

Misschien dat de boeken waarna u verwijst in uw post mij verder kunnen helpen? Heeft u hier misschien titels van? en mogelijk ook plekken waar ik deze kan kopen? (Uiteindelijk zijn de boeken toch voor mijn studie en vind ik het niet erg om ze aan te schaffen)

Het klopt: 1 gek kan meer vragen stellen dan 10 wijzen kunnen beantwoorden. Maar deze 10 wijzen kunnen die ene gek misschien wel héél erg op weg helpen, wat die ene gek ook enorm waardeert!

[Gerard]

Een boek The Immunoassay Handbook edited by DAVID WILD

Nature Publishing Group 2001

ISBN 1-56159-270-6

Antibodies a laboratory manual Ed Harlow David Lane

Cold spring Harbor Laboratory 1988

ISBN 0-87969-314-2

3 - is het mogelijk om bijv een cup te coaten met antigenen uit een vaccin

Ik heb gekozen omdat voor een allergeen makkelijke te zien is wat er moet gebeuren en er minder kans is op kruisreacties met andere eiwitten in het allergeen.

Als je begint met een vaccin is de opzuivering een gigantische klus want je moet zeken weten dan de antilichamen in het bloed het eiwit is dat je uiteindelijk meet in de assay.

Dus niet een van de andere eiwitten uit het vaccin die aan de cup kunnen binden ook door je afweersysteem herkend kunnen worden.

Maar overal kloppen je aannames maar het omzetten in de praktijk tot een werkzame elisa is een kompleet ander verhaal

[Danoontje]

Oke bedankt, dan ga ik zowiezo eens op zoek naar deze boeken.

Zijn er verder nog mensen die via dit forum hun kennis met mij willen delen omtrent bovenstaande vragen?