Fysiologisch zout en eiwit

[Bash_CF]

Dag mensen,

Ik ga binnenkort een vetzuuranalyse uitvoeren op bacteriën. Hiervoor ben ik al het één en ander te weten gekomen over de exacte preparatiestappen. Eén daarvan is het toevoegen van hexaan nadat transesterificatie (omestering) is uitgevoerd. Hierdoor worden de vetachtige stoffen van de overige stoffen gescheiden, omdat de vetachtige stoffen als enige goed oplossen in het apolaire hexaan.

Er is mij echter ook aanbevolen fysiologisch zout (0,9 % NaCl) toe te voegen, zodat de scheiding tussen hexaan en water beter optreedt. Mijn vraag is: waarom is dit?

Het heeft iets te maken met het vast worden van eiwit, heb ik nog kunnen begrijpen en dit is op zich logisch doordat de toevoeging van NaCl wellicht waterstofbruggen met het eiwit verbreekt, waardoor deze niet meer kan oplossen en als neerslag naar de bodem zinkt. Het is echter maar een inzicht, dus ik weet bij lange na niet wat voor chemische effecten het toevoegen van fysiologisch zout nu precies heeft. Weet iemand dit?

(Ik heb dit topic overigens onder microbiologie geplaatst, maar wellicht had dit onder gaschromatografie gemoeten. Excuus dan daarvoor.)

[Napoleon1981]

Dit heet uitzouten, je maakt het water nog polairder, waardoor je apolaire analiet nog meer naar de hexaan fase zal gaan. (Hexaan en water zelf zullen ook nog beter 2 lagen vormen)

[drune134]

Ik vermoed dat je voor het bereiden van methylesters van je vetzuren gebruik maakt van een methanolische BF3 oplossing. Na verzeping en omestering van je vet krijg je methylesters en glycerol gevormd. Door toevoegen van hexaan lossen je methyl-vetzuren hierin op, je glycerol blijft in de methanol-fase. je krijgt pas een scheidng van je hexaan en methanol door toevoegen van water. Echter er ontstaat dan vaak een emulsie. Door toevoegen van zout (NaCl) krijg je een betere scheiding van de twee lagen. Ook het 'uitzouten' van je methyl-esters gebeurt.

Voor de bereiding van methyl-esters van vetzuren gebruiken wij een verzadigde NaCl-oplossing, geeft nog minder kans op emulsie-vorming.

[Bash_CF]

Ik vermoed dat je voor het bereiden van methylesters van je vetzuren gebruik maakt van een methanolische BF3 oplossing.

Van wat ik heb gevonden weet ik alleen dat ik methanol moet gebruiken met een zuur of een base erbij om de omestering te katalyseren. De term "methanolische BF3 oplossing" ben ik eigenlijk nog niet tegen gekomen en ik weet daarom niet echt wat het betekent. Hoe dan ook, er wordt dus meestal geen puur methanol ("met een vleugje zuur") gebruikt?

Het uitzouten en de functie van water is echter volstrekt duidelijk. Echter is er nog één punt. In een protocol dat ik gelezen heb (voor scholieren) werd verteld dat de toevoeging van een zoutoplossing het eiwit ook vaster maakt (doet neerslaan). Uit het uitzouten begrijp ik echter alleen een grotere afstoting van de methylesters door het (zoute) water. Hoe wordt het eiwit dan vaster? Toch het verhaal van de waterstofbruggen of klopt het überhaupt niet (zo'n middelbaar protocol kan ook wel eens fout zijn )?

[drune134]

Ik ben niet bekend met bacteriën en vetzuren, de combinatie. Wij bepalen vetzuren in olie en vet, al dan niet geëxtraheerd uit voedingsmiddelen.

We gebruiken hiervoor twee methodes voor omestering. De BF₃-methode is met name voor het bepalen van olie en vet met een hoog vrij vetzuur gehalte.

In andere gevallen gebruiken we een methanolische KOH oplossing (2M KOH in methanol, gedroogd met een weinig Na₂SO₄).

Hiervoor neem je een weinig vet, max 100 mg, 4 ml iso-octaan (of hexaan) en 200 µl Meth. KOH opl. Schud gedurende 1 minuut op een vortex (of met de hand goed schudden, niet omzwenken) Daarna wordt een weinig NaHSO₄ toegevoegd om de reactie te stoppen. Je krijgt een omzetting van glycerol wat stoort bij de GC-bepaling. Daarna wordt Na₂SO₄ toegevoegd om de oplossing watervrij te maken. Deze laatste stap, wellicht beide laatste stappen, kun jij gerust vergeten want je voegt een zoutoplossing toe om het eiwit (wat jou uitgangsstof is?) vaster te maken en te doen neerslaan. Ik denk niet dat je een verz. NaCl oplossing hoeft te gebruiken, de eiwitten zullen wel neerslaan met fysiologisch zout.

Ik vermoed ook dat het toevoegen van 0,9% zout oplossing meer gedaan wordt om je eiwitten neer te slaan. Het 'uitzout-effect' is dan mooi meegenomen.

En, leerzaam voor mij, misschien dat een bacterioloog jouw wat verder kan helpen voor wat het eiwit-verhaal betreft.

succes