Neutralisatie enzym immunoassay

[lain]

hallo iedereen,

voor het werk ben ik een neutralisatie enzym immuno assay aan het opzetten.

Het doel is om te kijken of virussen geremd worden door bepaalde middelen.

Nou heb ik een probleem want het conjugaat plakt op een of andere manier aan mijn cupjes vast wat ik er niet uit kan wassen..

Weet iemand een manier van voorbehandelen van de cupjes zodat dit niet meer zou kunnen gebeuren?

[Gerard]

Hallo Heleen,

Van harte welkom op het forum.

Normaliter wordt voor de toevoeging van conjugaat een blocking stap uitgevoerd met BSA, HSA , vetvrije melkpoeder o.i.d, dat deze plak voorkomt.

Als je dit al doet moet je uitgebreider beschrijven hoe je test inelkaar zit want je verstrekt zo erg weinig informatie en dan is meedenken erg moeizaam.

typo

[lain]

nee ik gebruikt nog geen blocking stap, volgens mij..

Ik kan de test wel even kort uitleggen,

Ik coat de platen zelf met een cellaag. hier voeg ik virus aan toe en patiënten serum. Dit wordt ON geïncubeerd bij 37C. Als het virus geneutraliseerd wordt door het serum zou er alleen een cellag zijn na die incubatie.

Dit wordt gefixeerd.

daarna gewassen.

Daarna 1 uur geïncubeerd met HRPO gelabelde antilichamen.

Wassen

Substraat toevoegen en na weer incuberen de stop toevoegen.

Het probleem is alleen dat ik bij een leeg cupje waar ik alleen conjugaat, wassen, substraat, stop aan toevoeg, de hoogste waarde krijgt als ik em meet.

Dit zou volgens ons dus aan het conjugaat moeten liggen (substraat is goed dat is mee getest)

Is dit genoeg info??

[lain]

oh ja nog 1 vraag..

ALs ik 1 van die blockers gebruik die jij noemt, welke kan ik dan het beste gebruiken? En zijn er nog verschillen tussen de verschillende BSA's, HSA's enz?

Staan er veel verschillende bij de leverancier nl

[Gerard]

Ik werk met immunoassays voor eiwitten en heb dus geen ervaring met het gebruik van elisa's in virologie.

Ik zou inderdaad een blokkingstap invoegen voor je incubatie met antiichamen want de kans is vrij groot dat je te maken hebt met aspecifieke bindig van je antilichamen.

Welke blocking reagens je moet gebruiken is een kwestie van proberen.

Als je haast hebt zou je in je pauze naar AH kunnen gaan en een pakje Campina ELK melkpoeder kopen en met een 1% oplossing in buffer (bv PBST) kunnen blokken 1 uur

Zelf werk ik meestal met BSA omdat ik dat nu eenmaal in de koelkast heb staan en zolang het werkt test ik geen andere. Op western blots heb ik regelmatig melkpoeder gebruikt om te blokken en dat ging prima.

[lain]

de melkpoeder hebben we al een keertje gekocht dus die hebben wij in de koelkast staan:P

Ik ga de test volgende week meteen proberen!!

Heel erg bedankt..

gr,

Lain

[lain]

bij welke temperatuur zou je die blokker het beste kunnen incuberen?

4C, kamertemp of 37C

[Gerard]

Helaas is er voor incubatieperiodes geen vaste regel, als ik test begin ik standaard met 1 uur bij kamertemperatuur of als het zo uitkomt overnacht in de koelkast.

Bij het opzetten van een nieuwe test start ik normaal met een protocol dat voor een soorgelijk eiwit bestaat en en als er problemen zijn ga ik uitzoeken welke varianten het probleem verminderen of opheffen.

Een basis voor een eiwit elisa waar ik meestal van uitga bestaat uit de volgende opzet

Overnacht coaten van de plaat met een capture-antilichaam in de koelkast.

3 x spoelen met buffer (PBST 0,2%).

blokken met BSA kamertemepratuur (RT)

3 x spoelen met buffer

1 uur incuberen met standaarden en serum RT

3 x spoelen met buffer

2 uur incuberen met detecting gelabeld antilichaam RT

3 x spoelen met buffer

Substaat toevoegen, incuberen tot voldoende ontwikkeling en aflezen RT

[lain]

euuhhmm....

nou heb ik de blocking stap getest,

Dit werkte ook...

Totdat ik daarna de eerste test met monsters ging doen.. Al mijn waardes zijn weer veel te hoog dus er is nog steeds iets mis met het conjugaat in de cupjes?? ook mijn negatieve en positieve controle zijn verhoogt, dus het ligt niet aan de monsters.

Iemand een idee??

[Gerard]

Even voor mijn begrip, in een well die je geblokt hebt met melkpoeder vindt je als je daarna 1 uur geïncubeerd hebt met HRPO gelabelde antilichamen, wassen ,substraat en stop een resultaat gelijk aan een lege well met substraat en stop.

Met cellen en serum heb je weer te hoge resultaten?

[lain]

ja,

Al mijn waarden worden weer veel te hoog... ook van mij celcontrole en mijn virus controle,

terwijl toen ik teste mijn viruscontrole ook nog mooi gemiddeld lag..

Ik heb een goede run gehad en gister was ie dus weer niet goed..

Heb je misschien nog ideeen???

Wij komen er hier met zn allen niet meer uit...

[Gerard]

Is het mogelijk dat de cellen waarmee je coat een autologe peroxidaseactiviteit bezitten die je substraat omzet?

[lain]

Ik zal het eens even gaan nakijken.. Ik gebruik gewoon MK2 cellen

Maar het vreemde is dat de test 1 keer wel goed is gegaan...

Als het aan de cellen ligt zou het elke keer niet luken neem ik aan toch??

[Gerard]

Ik werk zelf helemaal niet met cellen, op dat punt kan ik je niet verder helpen.

Ik vraag me wel af of de virussen die toevoegt geen effect kunnen hebben op de cellen waardoor deze een of andere vorm van peroxidase activiteit vertonen of misschien zelfs reactieve stoffen produceren die zelf het substraat kunnen omzetten.

Als het aan de cellen ligt zou het elke keer niet luken neem ik aan toch??

Ik heb al zulke onverklaarbare dingen gezien bij ELISA's dat ik zoiets niet meer durf te beweren :eusa_sick:

[lain]

Ik denk niet dat het aan het virus ligt aangezien de cupjes waar ik alleen cellen in doe ook veel te hoog in waarde zijn..

Ik denk dat ik de test nog maar een keer opnieuw ga doen met de autologe peroxidase activiteit in mijn achterhoofd.. Zal er eens wat over op proberen te zoeken..

Dank je wel iig