RNA isolatie Aspergillus fumigatus

[Erjee]

Allen,

Momenteel ben ik bezig met het onderzoeken van genexpressie in Aspergillus fumigatus, een schimmel. Genexpressie meten we via RT-QPCR na isolatie van RNA. We dachten dat dit allemaal soepeltjes liep, maar nadat we een meting hadden gedaan voor DNA contaminatie, bleek de concentratie contaminerende DNA hoger dan de RNA concentratie te zijn. Iets wat niet goed is.

RNA isolatie wordt uitgevoerd na het drogen van mycelium matten, onderdompeling in vloeibaar stikstof en het beaten van de matten, met een QIAGEN RNA isolatie kit voor schimmels. Waarschijnlijk gaat er bij het beaten veel RNA verloren -voor de rest werken we RNase vrij- dus mijn vraag is of er iemand een andere manier weet waarbij de mechanische destructie van de cellen achterwege wordt gelaten, zodat er meer RNA overblijft? Misschien iets enzymatisch?

Ohja, we gebruiken ook een DNase stap om contaminerend DNA te verwijderen, maar blijkbaar heeft dit ook weinig nut.

Ik zie jullie reacties graag te gemoet!

Alvast bedankt!

[Roy van Heesbeen]

Als je een specifieke RNA isolatie kit gebruikt voor schimmels, dan zou die toch prima moeten werken. Ik zou even bekijken of er iets in de handleiding staat om je opbrengst te verhogen.

Weet je zeker dat al je reagentia in orde zijn? Zoals DNases e.d.