HRP chromogeen catalyse

[BioChem_CF]

Hallo,

op het moment probeer ik uit te zoekken hoe bij immunoperoxidase labels het chromogeen (DAB, AEC) wordt omgezet in een onoplosbaare kleurstof. Ik weet de reactie van HRP met waterstofperoxide en een substraat:

H₂O₂+2sbubstraat----> 2H₂O+2substraat*

Dit staat ook wat mooier uitgelegd in deze paper: Horseradish peroxidase: a modern view of a classic enzyme.

Helaas staat er niet in wat er gebeurt met de radicalen. Reageren deze met elkaar? of worden deze nog een keer geoxideerd? Ik heb een vergelijkbare thread over een ELISA gelezen maar die beantwoordde mijn vraag niet helemaal.

Daarnaast vraag ik mij af waarom AEC meer achtergrond kleuring geeft dan DAB. DAB is gevoeliger vanwege de vele ammino groepen die geoxideerd kunnen worden tegenover de ene aminogroep die AEC heeft, maar verder zie ik het niet zo snel.

Alvast bedankt.

[RubenM]

De reactie staat in deze paper wel heel algemeen uitgelegd, en dan vooral vanuit het uitgangspunt van het enzym.

De typische basis voor een chromogene reactie die gebruikt wordt met HRP is de omzetting van een difenol in een quinon. Je krijgt hier in één molecuul twee losse elektronen, die vervolgens opnieuw reorganiseren.

Bij DAB gebeurt iets vergelijkbaars: H₂N-Ph(NH₂)-Ph(NH₂)-NH₂ wordt geoxideerd tot 4,4′-diimino-bicyclohexylidene-2,5,2′,5′-tetraeen-3,3′-diamine. zie hier (ik hoop dat de link het doet)

Alleen de aminogroepen in para-positie worden dus geoxideerd!

Deze verandering in het geconjugeerde pi-systeem zorgt voor een verandering in kleur.

Je kunt niet zomaar zeggen dat de gevoeligheid toeneemt met het aantal aminogroepen. De redoxpotentiaal en pH-gevoeligheid van het chromogeen zijn factoren die bijdragen aan de mate van achtergrondkleuring en daarom kan het zijn dat in verschillende situaties verschillende chromogenen de optimale keuze zijn.

[BioChem_CF]

Bedankt .

Ik dacht al dat er een geconjungeerd systeem moest ontstaan, ik wist alleen niet hoe. DAB wordt dus 2 maal geoxideerd.

Maar, wat ik mij afvraag is hoe het dan werkt met AEC. AEC heeft maar een NH₂ groep die geoxideerd kan worden waardoor er dus maar 1 electron kan reconfigureren. Enig idee hoe dat werkt?

[RubenM]

Klopt, en wat je hier krijgt is een typische "azo-dye": twee AEC (3-amino-9N-ethylcarbazol) moleculen gaan aan elkaar hangen via een -N=N- brug.

[BioChem_CF]

Als er een -N=N- brug wordt gevormd zitten er wel nog 2 protonen in de weg. Bij de oxidatie van NH₂ ontstaat NH* als dat reageert met nog een NH* groep ontstaat er een -NH-NH- binding. Toch?

[RubenM]

Maar de essentiële drijvende kracht is nu juist het creëren van een zo groot mogelijk geconjugeerd systeem! Dus oxideert het gemakkelijk door tot -N=N-.

[BioChem_CF]

Dan zal dat dus de reden zijn dat er natriumacetaat in mijn AEC cocktail zit . Die zal de protonen die nog aan de stikstofatomen zitten er relatief makkelijk af kunnen halen.

Bedankt voor je hulp.

[RubenM]

Ik denk dat de H-tjes eerder eraf geoxideerd worden, niet als protonen door acetaat erafgehaald.

[BioChem_CF]

Hoe gebeurt dat dan? Het peroxide wordt gebruikt tijdens het catalyseren van de radicaalvorming. verder zit er nog DMSO in mijn cocktail en acetaat. Er valt niet veel meer te oxideren denk ik. Of reageert het peroxide met de protonen misschien nog tot water?

[RubenM]

De N-H bindingen worden als het ware doormidden gehakt, waarbij de H'tjes er als H· vanaf vliegen. Er wordt gewoon nog een molecuul waterstofperoxide aangesproken, volgens

RH₂ + H₂O₂ -> R + 2H₂O

waarin RH₂ = R'-NH-NH-R' en R = R'-N=N-R'

DMSO zit in je cocktail om je enzym te stabiliseren.

[BioChem_CF]

Weet je ook hoe het DMSO het enzym stabiliseert? Ik nam aan dat het DMSO er in zat omdat de AEC niet oplost in water. Althans dat denk ik want er heb meerdere MSDS charts gevonden waar tegenstrijdige informatie op staat wat betreft de oplosbaarheid van AEC. En het lijkt me sterk dat er gewoon radicalen worden gevormd, die zijn zo instabiel dat het energetisch gunstiger is om geen volledig geconjungeerd molecuul te vormen.

[RubenM]

Het zal een combinatie van beide zijn. Ik vermoed dat AEC voldoende oplosbaar is in water om dergelijke assays mee te doen, maar het zal niet overhouden.

Eiwitten die normaal in cellen zitten hebben allerhande interactie met andere eiwitten, membranen enz. Als je ze uit hun normale systeem haalt, kan het zijn dat hun structuur verandert, bijvoorbeeld omdat de hydrofobe gedeelten meer naar binnen vouwen.

Ter illustratie: dit artikel beschrijft de stabiliteit van HRP in een DMSO/water mengsel.

En het lijkt me sterk dat er gewoon radicalen worden gevormd, die zijn zo instabiel dat het energetisch gunstiger is om geen volledig geconjungeerd molecuul te vormen.

Die opmerking begrijp ik even niet.

[BioChem_CF]

QUOTE

En het lijkt me sterk dat er gewoon radicalen worden gevormd, die zijn zo instabiel dat het energetisch gunstiger is om geen volledig geconjungeerd molecuul te vormen.

Die opmerking begrijp ik even niet.

Wat ik bedoel is dat het volgens mij waarschijnlijker is dat de protonen zullen reageren. Radicalen zijn erg onstabiel en zullen dus ook niet zomaar ontstaan, radicalen ontstaan gewoonlijk alleen maar bij extreme condities.

[RubenM]

Wat ik bedoel is dat het volgens mij waarschijnlijker is dat de protonen zullen reageren. Radicalen zijn erg onstabiel en zullen dus ook niet zomaar ontstaan, radicalen ontstaan gewoonlijk alleen maar bij extreme condities.

Die H's gaan er niet als protonen af. Dit zou resulteren in twee stikstoffen met een minlading naast elkaar. Op zich kan dat best: kijk maar naar bijv. het mechanisme van de luminolreactie, maar daar worden die naburige negatieve ladingen sterk gestabiliseerd en leidt een en ander uiteindelijk tot vorming van N₂. Tevens wordt in de luminolreactie voor een dergelijke deprotonering doorgaans een sterk basisch milieu (zo'n 1 M NaOH!) gebruikt.

Daarbij, wat denk je dat met deze twee vrije elektronenparen gaat gebeuren? Al zou je een -N=N- binding bouwen, dan heb je nog een vrij paar over!

Je opmerking dat radicalen alleen maar bij extreme condities ontstaan is ook niet waar. Veel zwakke bindingen (lage dissociatie-energie, denk aan de moleculen van de halogenen en organische peroxiden) kunnen onder heel milde condities homolytisch splitsen.

Kortom: het is veel waarschijnlijker dat de beide stikstoffen hun H kwijtraken dmv een redoxreactie dan door een zuur-base reactie.

[BioChem_CF]

Je hebt gelijk radicalen kunnen ook onder milde condities ontstaan. Toch geloofde ik het niet helemaal dat er zomaar waterstof radicalen zouden gaan vliegen dus ik heb het eens voorgelegd aan een organicus en hij vertelde me het volgende:

Waterstofperoxyde splitst homolytisch op in 2 hydroxylradicalen die waarschijnlijk reageren met een non bonding electron van het stikstof. Hierdoor ontstaan er een aryl radicaal: Aryl-NH en hydroxyde, vervolgens vindt er een zuur base reactie plaats waarbij water en een Aryl-N radicaal worden gevormd. Dit gebeurt 2 keer per molecuul zodat er Aryl-N*-*N-Aryl ontstaat. De vrije electronen zullen vervolgens een pi binding vormen zodat Aryl-N=N-Aryl ontstaat.