Hallo mensen!
Ik heb ff een vraagje. Ik loop sinds een paar maand stage. Ik moet voor het virus MVM (Minute Virus of Mice) een indirecte ELISA opstellen (er wordt nu IFT gebruikt voor dit virus, maar deze geeft niet altijd even duidelijk uitsluitsel of een serummonster positief of negatief is).
Nu heb ik al antigeen geproduceerd. Ik heb gister hiermee een ELISA uitgevoerd. Daarbij heb ik ook positieve controles meegenomen van andere virussen. Nu bleek tot mijn verbazing dat (bijna) alle "andere" positieve controles van virussen (o.a. Sendai, Reo, PVM, enz) een hele hoge extinctie gaven. De meesten gaven zelfs een extinctie boven de 2.
Nou vraag ik mij eigenlijk af hoe dit kan? Het moet haast naar mijn mening een aspecifieke binding zijn. Ik heb namelijk ook monsters meegenomen die met de IFT negatief voor MVM gebleken zijn en deze gaven allemaal een negatief signaal.
Ik hoop dat iemand mij kan helpen, alvast bedankt voor jullie hulp!
Groetjes Linda
indirecte ELISA voor mijn stage
Moderator: ArcherBarry
-
linnie1987
- Artikelen: 0
- Berichten: 2
- Lid geworden op: do 08 jan 2009, 09:23
-
Silke_CF
- Artikelen: 0
- Berichten: 2
- Lid geworden op: do 14 feb 2008, 14:30
Re: indirecte ELISA voor mijn stage
Linda!
Zoals je al aangeeft is jouw ELISA niet specifiek genoeg. Maar ik snap niet precies hoe jouw ELISA in elkaar steekt. Wordt er gecoat met antilichaam of met antigeen? en wat bind er dan? En daarna ga je kleuren? Komt er dan nog een antilichaam bij of heb je een eigen antilichaam gecoat met conjugaat?
Groetjes!
Zoals je al aangeeft is jouw ELISA niet specifiek genoeg. Maar ik snap niet precies hoe jouw ELISA in elkaar steekt. Wordt er gecoat met antilichaam of met antigeen? en wat bind er dan? En daarna ga je kleuren? Komt er dan nog een antilichaam bij of heb je een eigen antilichaam gecoat met conjugaat?
Groetjes!
-
linnie1987
- Artikelen: 0
- Berichten: 2
- Lid geworden op: do 08 jan 2009, 09:23
Re: indirecte ELISA voor mijn stage
Mijn ELISA gaat als volgt:
- coaten met eigengemaakt antigeen en overnacht incuberen
- wassen
- blokken met blokbuffer (1 uur bij 37C incuberen)
- wassen
- antilichaam (=muizensera) dr bij (1 uur bij 37C incuberen)
- wassen
- conjugaat dr bij (1 uur bij 37C incuberen)
- wassen
- substraat (TMB) dr bij (10 min bij kamertemp. incuberen)
- reactie stoppen met zwavelzuur
- extinctie meten
Ik heb het er nog met mijn stagebegeleider er over gehad. Hij had hierover nog een idee. Ik zal eerst ff uitleggen hoe ik antigeen maak.
Om antigeen te kweken ent ik virus op BHK-21 (Baby Hamster Kidney) cellen. Na een aantal dagen ontstaat er CPE (CytoPathogeenEffect). Dan worden de cellen kapot gemaakt door een paar keer te vriezen en ontdooien. De suspensies worden afgedraaid om het meeste celmateriaal kwijt te raken. Vervolgens wordt het supernatant overnacht afgedraaid in een ultracentrifuge. De pellet is dan het antigeen en dit wordt nog opgelost in PBS.
Mijn stagebegeleider dacht dus dat er misschien aspecifieke binding plaatsvindt aan de BHK cellen die er nog eventueel in kunnen zitten. Om deze binding kwijt te raken stelde hij voor om de controles, die een hele hoge extinctie gaven, overnacht te laten incuberen met BHK cellen. Ik ga dit morgen uitproberen, dus woensdag heb ik resultaat (goed hoop ik
).
Verder weten ze het hier eigenlijk ook niet waar het aan kan liggen.
Groetjes Linda
- coaten met eigengemaakt antigeen en overnacht incuberen
- wassen
- blokken met blokbuffer (1 uur bij 37C incuberen)
- wassen
- antilichaam (=muizensera) dr bij (1 uur bij 37C incuberen)
- wassen
- conjugaat dr bij (1 uur bij 37C incuberen)
- wassen
- substraat (TMB) dr bij (10 min bij kamertemp. incuberen)
- reactie stoppen met zwavelzuur
- extinctie meten
Ik heb het er nog met mijn stagebegeleider er over gehad. Hij had hierover nog een idee. Ik zal eerst ff uitleggen hoe ik antigeen maak.
Om antigeen te kweken ent ik virus op BHK-21 (Baby Hamster Kidney) cellen. Na een aantal dagen ontstaat er CPE (CytoPathogeenEffect). Dan worden de cellen kapot gemaakt door een paar keer te vriezen en ontdooien. De suspensies worden afgedraaid om het meeste celmateriaal kwijt te raken. Vervolgens wordt het supernatant overnacht afgedraaid in een ultracentrifuge. De pellet is dan het antigeen en dit wordt nog opgelost in PBS.
Mijn stagebegeleider dacht dus dat er misschien aspecifieke binding plaatsvindt aan de BHK cellen die er nog eventueel in kunnen zitten. Om deze binding kwijt te raken stelde hij voor om de controles, die een hele hoge extinctie gaven, overnacht te laten incuberen met BHK cellen. Ik ga dit morgen uitproberen, dus woensdag heb ik resultaat (goed hoop ik
). Verder weten ze het hier eigenlijk ook niet waar het aan kan liggen.
Groetjes Linda
-
Silke_CF
- Artikelen: 0
- Berichten: 2
- Lid geworden op: do 14 feb 2008, 14:30
Re: indirecte ELISA voor mijn stage
Mogelijke problemen die ik zie:
Jouw cellen maken nog meer antigenen aan welke ook afgecentrifugeerd worden en je dus ook meeneemt in de ELISA --> neem eens een HPLC om te kijken of je wel zuiver antigeen hebt.
Je antigeen heeft meerdere epitopen waardoor er aspecifieke binding plaatsvindt. --> antigeen knippen en juiste epitoop zuiveren (volgens mij is dat al een stageopdracht op zich)
misschien bindt je muizensera wel gewoon aspecifiek, bijvoorbeeld muizen IgG dat ook gewoon bindt aan jouw antigeen.
Waaruit bestaat je conjugaat, zijn het antilichamen? of is het alleen het enzym dat TMB omzet?
Als er nog cellen in jouw pellet zitten dan is de kans inderdaad heel erg groot dat je aspecifieke binding krijgt.
Omdat je zei dat bij de negatieve controles je ook een negatief signaal krijgt is heb je geen aspecifieke binding van je serumeiwitten (IgG, albumine etc.). Dan zou je namelijk altijd een positief signaal krijgen. ik heb dan ook het vermoeden dat je antigeen niet is wat het is. uit jouw verhaal maak ik op dat je alleen al-ag binding hebt en geen "echte" aspecifieke binding.
misschien is het een idee om eens te kijken op www.kpl.com hierop staan een aantal handleidingen voor het opzetten en valideren van een ELISA. Ik heb ze ook naar Paul en Rens gemaild dus als je ze niet kan vinden dan hoor ik het wel. Ik heb er heel veel aan gehad.
Groetjes!
Jouw cellen maken nog meer antigenen aan welke ook afgecentrifugeerd worden en je dus ook meeneemt in de ELISA --> neem eens een HPLC om te kijken of je wel zuiver antigeen hebt.
Je antigeen heeft meerdere epitopen waardoor er aspecifieke binding plaatsvindt. --> antigeen knippen en juiste epitoop zuiveren (volgens mij is dat al een stageopdracht op zich)
misschien bindt je muizensera wel gewoon aspecifiek, bijvoorbeeld muizen IgG dat ook gewoon bindt aan jouw antigeen.
Waaruit bestaat je conjugaat, zijn het antilichamen? of is het alleen het enzym dat TMB omzet?
Als er nog cellen in jouw pellet zitten dan is de kans inderdaad heel erg groot dat je aspecifieke binding krijgt.
Omdat je zei dat bij de negatieve controles je ook een negatief signaal krijgt is heb je geen aspecifieke binding van je serumeiwitten (IgG, albumine etc.). Dan zou je namelijk altijd een positief signaal krijgen. ik heb dan ook het vermoeden dat je antigeen niet is wat het is. uit jouw verhaal maak ik op dat je alleen al-ag binding hebt en geen "echte" aspecifieke binding.
misschien is het een idee om eens te kijken op www.kpl.com hierop staan een aantal handleidingen voor het opzetten en valideren van een ELISA. Ik heb ze ook naar Paul en Rens gemaild dus als je ze niet kan vinden dan hoor ik het wel. Ik heb er heel veel aan gehad.
Groetjes!
