Na een protocol opgemaakt te hebben, die goedgekeurd was door de leerkrachten, begonnen wij aan de uitvoering van onze detectie van eGFP.
De celcultuur die gebruikt werd waren HEK-cellen (293T) die via lentivirale vectoren eGFP bevatten.
De detectie gebeurde met:
- Monoclonaal antilichaam (Clontech; catalog# 632569)
- Geit anti muis IgG antilichaam AP conjugaat (Sigma-Aldrich; catalog# A3688)
- BCIP/NBT (Calbiochem; catalog# 203790)
Volgend resultaat werd bekomen:
http://img809.imageshack.us/i/img2246n.jpg
eGFP is 29.8 kDa dus zou wat onder de merker moeten zitten van 32.5 kDa.
Nu zitten er bij de positieve cellen 2 banden te zien. En nog lager een minder duidelijke, afgebroken lijn (stippellijn).
Ik moet binnen een week alles voorleggen aan een jury, en verwacht dus vraagstelling hierover. Alleen kan ik niet direct een antwoord geven.
Het is zeker geen aspecifieke binding van het secundair antilichaam, want dit is daarna getest op een blot en er waren geen banden te zien.
Alternative splicing kan het niet zijn, aangezien het cDNA is, dus is het ofwel aspecifieke binding van het primair antilichaam op een ander eiwit dat op de vector ligt (daar het enkel bij de positieve voorkomt). ofwel een soort glycolisatie
die verschilt afhankelijk van waar het eGFP zich bevindt in de cel. (Maar dit zou dan niet zo'n groot verschil geven denk ik).
En wat zijn die stippellijnen dan?
Ik hoop dat er iemand mij kan helpen,
alvast bedankt,
Wesley Viaene
