brockske schreef:

Napoleon1981 schreef:

Verder moet dit gewoon werken, ik zou nooit 100% water door een kolom gooien, gewoon ff 1% organisch dr bij doen. Als je een goede C18 kolom hebt, dan werkt dit gewoon. Probeer een langzame gradient te draaien als je "niets" ziet, misschien dat het op je kolom blijft hangen.

Er zijn C18 kolommen die te gebruiken zijn met 100 % water. BV Synergi hydro. Dat is een volledige C18 maar met polar endcapping. Synergi Fusion is ook een C18 met een polar embedded groep. Beide kolommen zijn dus te gebruiken met 100% water als mobiele fase. Beide kolommen zijn trouwens te verkrijgen bij Phenomenex

Synergi Hydro

Synerigi Fusion

Napoleon1981 schreef: Nogmaals dit is dus wel belangrijk

Je zegt in een andere post dat je NIETS ziet. Dit is dus detector gerelateerd.

Probleem met een standaard ODS (C18) kolom is dat je een collapse krijgt van de C18-staarten als je teveel water erdoor jaagt, dus dat ene procentje methanol/ACN maakt het volgens mij niet.

Volgens jou misschien niet, maar dat 1e procentje maakt dus juist al het verschil in de wereld. Het is 1 procent in de mobiele fase, maar wat denk je dat er gebeurd op een hydrofobe kolom? Juist lokaal is de concentratie veel hoger omdat het zich ophoopt als gevolg maakt dat 1% procentje dus een wereld van verschil. Van niets naar 1% is trouwens ook een mega verhoging relatief gezien.

Nog een tip, het klakkeloos kopieren van andere mensen hun methoden is zinloos, je schiet veel meer op met even helder denken waarom bepaalde dingen zo zijn en variabelen te selecteren die voor jou systeem optimaal zijn. Je draait een kolom altijd bij de juiste flowrate die bij die kolom hoort. Alle methoden die je opnoemt gebruiken trouwens gewoon een zure mobiele fase en welk zuur dat is maakt niet zoveel uit. Kolommen kunnen overig goed tegen zuur, het zijn de basen die ze vernielen.

brockske schreef:

Napoleon1981 schreef: Ik zou eerder bij 210 gaan meten of 214. Dan zit je verder weg van de solvent background.

Verder moet dit gewoon werken, ik zou nooit 100% water door een kolom gooien, gewoon ff 1% organisch dr bij doen. Als je een goede C18 kolom hebt, dan werkt dit gewoon. Probeer een langzame gradient te draaien als je "niets" ziet, misschien dat het op je kolom blijft hangen.

Als je het echt niet uit het solvent front krijgt, probeer dan een ionpaar reagens (alkyl-quaternairy ammonium ofzo) bij pH 6. Dan heb je zeker een sterke retentie en een significante hoeveelheid organisch nodig om het er af te krijgen

Leon

Mja nogmaals, de golflengte is niet zo belangrijk. Moest de piek inderdaad in de solventachtergrond vallen, dan kan ik gewoon een andere interessante golflengte kiezen m.b.v. de software.

Probleem met een standaard ODS (C18) kolom is dat je een collapse krijgt van de C18-staarten als je teveel water erdoor jaagt, dus dat ene procentje methanol/ACN maakt het volgens mij niet.

Ik probeer 'm morgen eerst nog met de laatste methode die ik vond, zijnde 10 mM KH₂PO₄/MeOH 95:5, isocratisch op 0,8 ml/min.

Moest dat weer niks opleveren dan ga ik verder in de richting die jij me hier aanraadt. Even opzoeken hoe dat ook alweer zat allemaal..

wat is de samenstelling van je eluent?

en wat is de pH van je eluent?

Dat varieert dus. Ik heb er eentje op 6 mM H₃PO₄ gedraaid, die had pH 2 komma nog iets, dus de kolom moet er tegen kunnen. Een andere was op 0,02 % HCOOH, dus die pH lag nog wat hoger. Oplossingen werden overigens in water gemaakt (milli-Q).

Mja nogmaals, de golflengte is niet zo belangrijk. Moest de piek inderdaad in de solventachtergrond vallen, dan kan ik gewoon een andere interessante golflengte kiezen m.b.v. de software.

Probleem met een standaard ODS (C18) kolom is dat je een collapse krijgt van de C18-staarten als je teveel water erdoor jaagt, dus dat ene procentje methanol/ACN maakt het volgens mij niet.

Napoleon1981 schreef: Ik zou eerder bij 210 gaan meten of 214. Dan zit je verder weg van de solvent background.

Verder moet dit gewoon werken, ik zou nooit 100% water door een kolom gooien, gewoon ff 1% organisch dr bij doen. Als je een goede C18 kolom hebt, dan werkt dit gewoon. Probeer een langzame gradient te draaien als je "niets" ziet, misschien dat het op je kolom blijft hangen.

Als je het echt niet uit het solvent front krijgt, probeer dan een ionpaar reagens (alkyl-quaternairy ammonium ofzo) bij pH 6. Dan heb je zeker een sterke retentie en een significante hoeveelheid organisch nodig om het er af te krijgen

Leon

wat is de samenstelling van je eluent?

en wat is de pH van je eluent?

Napoleon1981 schreef: Wat scheiden van wat?

Citroenzuur van natriumcitraat? Dat gaat je niet lukken nee. 8-[ Bedenk je eens wat er gebeurd als je natriumcitraat in een zure mobiele fase stopt

Trouwens welke golflengte gebruik je?

Epyon schreef: waarschijnlijk heeft dit maar weinig effect maar is 0,3 ml/min niet iets aan de lage kant? Want ik weet dat de keren dat ik met HPLC heb gewerkt het altijd rond de 1ml/min was en deze snelheid wordt ook genoemd in beide links die ik gevonden had. In ieder geval zou je dan wel iets sneller een van de componenten moeten detecteren.

en wat zijn ongeveer je concentraties en injectie volume?

Velders schreef: Misschien een lullige opmerking maar, zou het aan de detector kunnen liggen?

Verder lijkt het mij dat de stuffen bij een C-18 kolom er nagenoeg meteen uit komen.